郭松 赵超 傅明骏 江世贵 杨其彬 邱丽华

摘要  [目的]利用卵巢组织石蜡切片自发熒光观察斑节对虾卵母细胞发育。[方法] 研究采用普通石蜡切片技术获得斑节对虾发育各期卵巢组织切片，采用苏木青/伊红染色后利用3种自发荧光对卵巢组织切片进行观察，探讨绿色自发荧光下观察卵母细胞不同发育阶段需要的最适曝光时间。[结果] 卵巢组织切片直接自发荧光观察卵母细胞的发育较HE染色后观察更为方便、有效，且切片可以继续用于后续试验。3种自发荧光中，绿色自发荧光的观察效果最好。[结论]  该研究可为快速观察斑节对虾卵母细胞发育和高效利用试验材料提供了新思路和新方法。

关键词 斑节对虾;卵母细胞发育;组织切片;自发荧光

中图分类号 S945.4+7  文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2015）03-136-06

Study on the Autofluorescence of Paraffin Section of Penaeus monodon

GUO Song¹， 2， ZHAO Chao¹， 3， FU Mingjun¹， 3， QIU Lihua¹， 3* et al

（1. South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou， Guangdong 510300; 2. College of Aqua-life Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization， Ministry of Agriculture， Guangzhou， Guangdong 510300）

Abstract     [Objective] The ovarian development of Penaeus monodon was observed by using auto-fluorescence of oocyte paraffin section. [Method] The paraffin section of ovary in P. monodon indifferent development stages by using common paraffin section technology. The ovary sections were observed by using three kinds of auto-fluorescences after hematoxylin and eosin dyeing. The optimum exposure time for different development stages of oocytes under green auto-fluorescence was discussed. [Result] It was more convenient and effective to observe the development of oocyte by using auto-fluorescence of ovary sections than that by HE dyeing. And the sections could be used in further experiments. Among three kinds of auto-fluorescence， the observation effects by using green auto-fluorescence was the best. [Conclusion]The research could provide new thought and method for the rapidly observing the development of P. monodon oocytes and effectively utilizing the test materials.

Key words   Penaeus monodon; Oocyte development; Tissue sections; Auto-fluorescence

基金项目 国家自然科学基金项目（31101903）;广东省海洋渔业科技推广专项（A201300B03）;广东省科技计划项目（2013B04 0402016）;海南省应用技术研发与示范推广专项（ZDXM2014057）;海南省自然科学基金（313117）。

作者简介 郭松（1987- ），男，河南淮滨人，硕士研究生，研究方向：水产养殖。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事水产养殖方面的研究。

收稿日期 20141119

斑节对虾（Penaeus monodon）作为世界三大对虾养殖品种之一^[1-3]，在国内外都有着大量研究报道。斑节对虾的全人工繁育技术已经成功，但斑节对虾卵巢发育的分子机理仍然不十分清楚。近年来，已有多个斑节对虾卵巢发育相关的基因被研究^[4-7]，组织切片观察是目前常用的鉴定卵母细胞发育的方法，以卵巢组织切片为基础的免疫组化、原位杂交等技术广泛应用于在研究卵巢发育相关因子在卵母细胞中的定位等研究中。目前采用的苏木青/伊红染色后观察操作繁琐且不利于切片的再利用，因此能够不通过染色直接通过切片鉴定卵巢组织切片卵母细胞的发育成为十分实用的方法。笔者首次在斑节对虾中报道卵巢组织切片自发光及其应用，采用普通石蜡切片技术获得斑节对虾卵巢发育各期卵巢组织切片，采用HE染色和卵巢组织切片自发荧光对切片进行了观察，并比较了各自的优缺点;利用3种荧光对观察卵巢组织切片，比较3种荧光的观察效果，并对绿色自发荧光最适曝光时间进行了探究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

斑节对虾来源于海南省三亚市野生捕捞，体重80～200 g，水温（25±1）℃、盐度为30‰的循环水池中暂养7 d。取发育至各期的卵巢中叶部分用Bouin氏液固定。

1.2 试验方法

1.2.1 组织切片。

用Bouin氏液固定样品24 h以上，流水浸泡2 h去除固定液，参照用 Bell方法 ^[8] 进行染色、切片和组织学观察。脱水使用Leica4-2429自动脱水机完成，LeicaEG1160组织包埋机进行石蜡包埋，Leica转轮式切片机切片，切片厚度设定为4 μm，使用LeicaAUTOSTAINER·XL染色机进行常规HE染色。

1.2.2 显微镜观察。

HE染色切片在ZEISS光学显微镜下观察并于适当倍数下拍照。未经任何处理的石蜡切片在AMG EVOS f1（LIFE，USA）荧光显微镜下观察并于适当倍数下拍照。3种荧光均是在60%光强、曝光250 ms下拍照;绿色自发荧光在不同曝光时间下观察卵母细胞发育不同状态，采用的是100%光强比较不同曝光时间下的拍照效果;荧光照片采用60%光强，曝光250 ms。

2 结果与分析

2.1 3种荧光观察效果的比较 从图1 可以看出，核仁期细胞和周边核仁期细胞在3种波段光的激发下呈现较为均匀的颜色，细胞核呈现黑色。卵黄囊卵母细胞和早期以及晚期的皮质棒期，绿色自发荧光能够较好地展示颗粒状的物质。皮质棒状体在3种自发荧光下呈现为黑色。在相同的曝光时间和光强下，3种颜色的自发荧光都可用于卵巢组织切片卵母细胞发育的观察。3种颜色的自发荧光中，绿色自发荧光在清晰度和观察范围上比红色和蓝色自发荧光好。

注：CN.染色质核仁期卵母细胞;PO.周边核仁期卵母细胞;YO.卵黄囊卵母细胞;CR.皮质杆状细胞。

图1 卵巢组织切片在3种荧光下自发荧光效果的比较

2.2 绿色荧光不同曝光时间下观察发育至各个时期的卵母细胞

從图2可以看出，在曝光时间为250 ms时观察效果最好，500 ms时出现曝光过度;从图3可以看出，在绿色自发荧光下观察卵黄囊卵母细胞需要曝光250 ms;从图4～5可以看出，在皮质棒期的卵母细胞，只需要60 ms曝光即可得到较好的观察效果。在60 ms曝光时间下，卵母细胞发育的不同形态均可以得到较为清晰的观察。

2.3 绿色荧光自发荧光与常规HE染色的效果比较

从图6可以看出，利用组织自发绿色自发荧光与常规HE染色相比能够更好地观察卵母细胞中的颗粒，且色彩鲜艳美观。在发育早期的卵母细胞中，常规HE染色观察结果背景较深;在卵黄囊卵母细胞期自发绿色自发荧光较好地展现了细胞质中的颗粒状物质及其分布的位置;在早期和晚期的皮质棒卵母细胞中，2种方法都能够很好地展示细胞中的皮质棒结

注：A.曝光时间15 ms;B.曝光时间30 ms;C.曝光时间60 ms;D.曝光时间120 ms;E.曝光时间250 ms;F.曝光时间500 ms。

图2 绿色自发荧光下观察核仁期细胞和周边核仁期细胞（20×）

注：A.曝光时间15 ms;B.曝光时间30 ms;C.曝光时间60 ms;D.曝光时间120 ms;E.曝光时间250 ms;F.曝光时间500 ms。

图3 绿色自发荧光下观察卵黄囊卵母细胞（10×）

注：A.曝光时间15 ms;B.曝光时间30 ms;C.曝光时间60 ms;D.曝光时间120 ms;E.曝光时间250 ms;F.曝光时间500 ms。

图4 绿色自发荧光下观察卵黄囊卵母细胞早期皮质棒期卵母细胞（10×）

注：A.曝光时间15 ms;B.曝光时间30 ms;C.曝光时间60 ms;D.曝光时间120 ms;E.曝光时间250 ms;F.曝光时间500 ms。

图5 绿色自发荧光下观察晚期皮质棒期卵母细胞（10×）

安徽农业科学                         2015年

构，但在皮质棒间隙中的颗粒状物质的展示上，组织自发绿色荧光的观察效果优于常规HE染色。

3 讨论

海洋生物或者其组织能够激发后发出荧光是较为普遍的现象，如目前广泛应用的绿色荧光蛋白（GFP）^[9-12]。与生物发光现象不同，自发荧光一般需要荧光蛋白被一定范围波长的激光激发。荧光蛋白主要应用在与抗体、生物素、免疫蛋白等物质结合作为荧光探针，通过激发发出的荧光对相关物质的分布等进行研究。斑节对虾卵巢组织石蜡切片能够自发荧光的现象对于研究斑节对虾卵母细胞的发育具有重要意义。

该试验中使用的荧光显微镜3种荧光模块（DAPI、GFP、RFP）分别能够产生360、470和530 nm的激发光，分别激发产生447 nm的蓝色荧光、525 nm的绿色荧光和593 nm的红色荧光。3种激发光分别属于荧光显微镜常用激发片组：360 nm的激发光属于紫外光范围（330～400），470 nm属于蓝色片组（420～485），530 nm属于绿色激发片组（460～550）。斑节对虾卵巢组织石蜡切片能够被3种激发光激发，可能是因为自发荧光的物质的激发波长范围较广，根据该试验结果可

注：A～D：自发光;E～H：常规HE染色。

图6 绿色荧光组织自发荧光与常规HE染色的效果比较（10×）