田建平 胡远艳 张吉贞 张名楠 陈国良

摘要

[目的]對海南和广东2省6个产地的华南忍冬分子地理标识及生态因子的关系进行研究，以寻找其内在联系。[方法] 应用主成分分析和数量分类技术对华南忍冬6个产地的温度、水分、光照、经纬度等地理生态因子进行分析，通过psbAtrnH序列测序和分子指纹图谱分析，寻找不同产地的差异。[结果]可以将6个产区分为3部分，其中屯昌和琼中产区以年均降水量贡献值最大，韶关产区则以7月均最高温、经纬度贡献值最大;海口、文昌和湛江则以年均气温、年均相对湿度、1月气温等贡献值最大。基于psbAtrnH 序列对不同产地华南忍冬进行分子指纹图谱鉴别及分析，结果表明，利用 psbAtrnH 序列比对分析发现，华南忍冬不同产地间序列位点存在较大差异，保守位点有267 bp，占序列总长度的60.2%; 变异位点有182 bp，占序列总长度的39.8%， NJ tree 分析表明，华南忍冬2省6产区可分为3支，与基于地理生态因子的分类具有很强的相关性。[结论]该研究为进一步研究山银花的生态型和品质变异的生物学本质提供科学依据。

关键词 华南忍冬;生态因子;psbAtrnH序列;指纹图谱

中图分类号 S188  文献标识码

A  文章编号 0517-6611（2015）03-038-03

Study on the Correlation between Gene Sequence Characteristics of psbAtrnH and Ecological Factors of  Lonicera confusa

TIAN Jianping¹，HU Yuanyan²，ZHANG Jizhen²  et al

（1.Department of paharmacy，Hainan medical college，Haikou，Hainan 571199 ;2.Key Laboratory for Tropical Biological Resources，MOE，Hainan University，Haikou，Hainan 570228;3.Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract   [Objective]To discuss the relationship between molecular geographical indications and ecological factors of L.confusa，  the  relative datas from the six regions of Hainan and Guangdong province were studied.[Method]By using of principal component analysis（PCA） and quantitative classification technology，  geographical and ecological factors （ including temperature，moisture，illumination，latitude and longitude，etc） from  six areas  of L.confusa was analyzed. Through psbAtrnH sequencing and molecular fingerprintiny analysis， the difference from different habitats was found.[Result] The results showed that the six regions could be divided into three parts，and the Tunchang and Qiongzhong County have the maximum contribution value with the average annual rainfall ，Shaoguan region have the maximum contribution value with  the most high temperature in July，latitude and longitude. Haikou，Wenchang and Zhanjiang have the maximum contribution value with the annual temperature，relative humidity，air temperature of January，etc.Molecular fingerprint identification and analysis of L.confusa  based on the psbAtrnH sequences had been researched in different areas，the results had been showed that，there had existed sequence differences between different habitats， and the conservative sites were 267 bp，the mutation locus were 182 bp; NJ tree analysis showed that six areas of  L.confusa in southern China can be divided into three branches too，and it had  the strong correlation  between the results of classification based on geographical and ecological factors.[Conclusion] The study    provided the scientific basis for the biological nature for the further studies of variation of ecotypes and quality of Lonicerae flos.

Key words  Lonicera confuse; Ecological factors; psbAtrnH; Fingerprint

基金项目 海南省教育厅科学基金资助项目（Hjkj2012-29）。

作者简介 田建平（1972- ），男，湖南常德人，副教授，从事中药资源学研究。

收稿日期 20141204

道地藥材品质特征及其成因的系统研究一直是中药材科学研究中的热点和难点之一^[1]。由于遗传和生态因子等因素的共同作用导致种内变异是中药材品质不同的主要原因^[2]。由于其所具有的重要性，目前关于药材地理分布与遗传的相关性研究逐渐增多^[3]。

华南忍冬[Lonicera confusa （Sweet） DC.]为忍冬科多年生藤本植物，主要分布在广东、广西、海南等地，花供药用，为华南地区“山银花”中药材的主要品种，有清热解毒之功效^[4]。莫爱琼等^[5]利用随机扩增多态性（RAPD）技术分析了华南忍冬的遗传多样性，发现其具有较高水平的遗传多样性。居群间遗传分化程度较高（Gst=0.383 9）;地理距离与遗传距离之间具有显著相关性，表明地理隔离效应是导致居群间遗传分化的重要因素。psbA-trnH 基因间隔区居于编码光合系统Ⅱ反应中心DⅠ蛋白的psbA 基因和编码tRNA 组氨酸的trnH 基因之间，被认为是叶绿体基因组中进化速率最快的基因间隔区之一。目前，已将psbA-trnH 序列分析用于连翘〔Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl〕3 个居群和相关物种的遗传多样性研究^[6]。前期研究表明，华南忍冬不同产地同一类化学成分含量差异也较大^[7]，笔者运用主成分分析（PCA）和psbA-trnH基因序列差异聚类判别方法对分布在海南和广东两地的华南忍冬地理分布格局差异及分子地理特点进行研究，以深入阐明山银花（华南忍冬）中药资源品质差异内因，因而对促进山银花品质提升具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

于2013年分别从海南、广东等地进行样品采集，样品由海南医学院药学院田建平副教授鉴定为忍冬科植物华南忍冬[Lonicera confusa （Sweet） DC.]。凭证标本保存于海南医学院中药标本馆。

NaCl、CTAB、EDTA、Tris、氯仿、异戊醇、异丙醇均为分析纯，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR 反应试剂购自于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生态因子数据获取。

通过查询采样点附近各气象站所记录的气象数据，所提取的生态因子包括年均温、1月均温、1月平均最低温、7月均温、7月平均最高温、年均相对湿度、年均日照时数和年均降水量、经度、纬度等（表1），利用生态学软件canoco 5.0进行PCA分析，测定其PCA得分图与载荷图。

1.2.2 psbA-trnH序列。

1.2.2.1 基因组总DNA 提取。

每份样品取30～40 mg，液氮碾磨成细末，采用改良CTAB方法提取样品DNA。异戊醇沉淀，晾干，适量ddH₂O溶解，用PCR Products Purification kit（上海 Sangon 公司）纯化后，4 ℃贮存备用。

表1 华南忍冬采集样地生态因子

位点经度

E纬度

N年均

气温∥℃1月

均温∥℃1月均最

低气温∥℃7月

均温∥℃7月均最

高温∥℃年均相

对湿度∥%年均日

照时数∥h年均降

水量∥mm

海口110°19′20°10′24.217.214.628.433.184.802 069.51 664.0

文昌110°72′19°61′23.917.814.828.132.487.001 953.81 721.6

屯昌110°10′19°36′23.219.816.628.432.384.002 000.02 350.0

琼中109°83′19°05′22.516.512.828.533.084.601 743.12 444.0

湛江110°23′21°11′23.519.514.129.132.085.001 817.01 313.2

韶关113°33′24°48′19.715.57.028.034.077.001 499.71 522.0

1.2.2.2 psbA-trnH序列的PCR扩增及测序。

psbA-trnH 序列引物psbA3′f和trnHf_05分别为GTTATGCATGAACGTAATGCTC和CGCGCATGGTGGATTCAATCC。扩增反应在ABI型PCR 仪上进行。扩增反应体系总体积20 μl，含30 ng 模板DNA、10 × PCR buffer（含Mg²⁺）2 μl、10 mmol/L dNTPs 0.3 μl、5 μmol/L 引物2 μl和5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.2 μl，用灭菌双蒸水补足至20 μl。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，70 ℃延伸45 s，共30 个循环; 最后于72 ℃延伸5 min。PCR 扩增产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化后使用引物直接进行双向测序，测序由上海华大基因有限公司完成。

1.3 序列数据的处理

DNA序列的排序用DNAMAN软件完成，并辅以人工校对，排序后的序列使用分子进化遗传分析软件MEGA 6.06（molecular evolutionary genetic analysis）进行分析，以Kimura—2参数计算遗传距离，采用邻接法（neighbor—joining，NJ）与自展检验（Bootstrap）1000次构建系统发生树。

2 结果与分析

2.1 华南忍冬分布区域地理气候因子分析

通过对海南、广东华南忍冬分布区附近各气象站点提取生态因子，利用canoco软件对主产区海南、广东的生态因子进行PCA分析，得到PCA得分图和载荷图（图1）。由图1可知， 由于地理、气候等因子的不同，海南、广东6个分布区明显分为3种类型，其中海南产区屯昌、琼中以年均降水量贡献值最大，而海南文昌、海口、广东湛江以年均相对湿度、年均气温、7月均温、1月最低均温的贡献值最大，而生态因子7月均最高温度、经度、纬度则对广东韶关产区的贡献值大，正是这种生态因子的差异，导致华南忍冬海南和广东两大产区呈现不同的气候地理生态型。

图1 华南忍冬生态因子PCA得分图与载荷图

2.2 不同产地华南忍冬 psbAtrnH 序列特征比较

结合从Genbank中取得的华南忍冬湛江和韶关产的psbAtrnH序列（KM258576.1和KM258575.1），加上海南不同产地华南忍冬psbAtrnH序列变异位点分析， 运用DNAMAN软件对测序得到的序列文件进行拼接、比对。 6个不同地域华南忍冬psbA-trnH 序列的长度为451～552 bp，排序后两端切平获得的序列长度为443 bp，当空缺（gap） 始终作缺失（missing） 处理时，保守位点有267 bp，占序列总长度的60.2%; 变异位点有182 bp，占序列总长度的39.8%，变异类型主要为碱基缺失和替换（图2）。

运用MEGA6.06软件，通过序列比对分析，建立华南忍冬不同产地邻接树，可见华南忍冬2省6个产地明显分为3支，其中海口、湛江、文昌聚类为一支，韶关为一支，而海南琼中、屯昌聚为另一支（图3）。

3 讨论

受到特定自然生态环境的制约和影响，同一种中药材在不同产地长期趋异适应形成较为稳定的生态型，并在基因表达、生化等表型上表现差异，而这种差异是产生药材品质优劣和疗效差异的实质^[2]。 作为南药的一种，华南忍冬（山银花）产区主要分布在海南、广东、广西等地，分布地理环境有很大差异。研究表明，华南忍冬即使在同一产区其绿原酸化学成分含量也有较大差异^[8] ，该差异的形成是由于与其分布的广西特殊石灰岩环境有关。该研究通过对地理分布格局具有较大差异的其他2个道地产区的华南忍冬进行分子地理标识及气候生态因子的进一步研究，证实了气候因子在药材生产布局中的重要性。

由于地理隔离效应，加上包括地理环境特征在内的生态因子等因素的影响，华南忍冬存在种内分化，进一步导致不同地域的华南忍冬植物体内次生代谢反应的强度和途径产生差异，最终对药材的品质产生重要影响。莫爱琼等^[5]对华南忍冬居群遗传多样性的RAPD分析已证实华南忍冬存在种类分化，该研究从psbAtrnH序列的角度比较了华南忍冬在海南、广东两省的分子地理特征，结果表明，华南忍冬的psbAtrnH序列位点在广东、海南两省分布区具有一定范围的碱基变异。基于psbAtrnH序列差异的NJ树聚类分析结果中，海南海口、文昌、湛江聚为一类，广东韶关聚为一类，海南屯昌、琼中聚为另一类。这与基于主成分分析基础上的华南忍冬分布区的分析结果具有很强的相关性。该研究表明，植物遗传特征与气候因子影响具有密切的关系，有关肉苁蓉生态型研究类似的结果也证明了上述关系^[9]。因此该研究对于今后进一步研究华南忍冬的地理生态型具有重要的参考价值。

图2 6个不同地域华南忍冬psbAtrnH 序列特征

图3 基于6个不同地域华南忍冬psbAtrnH 序列特征基础的NJ聚类图

由于在海南华南忍冬为野生状态分布，规模化种植基地主要分别在湛江等地，该研究结果不仅对于今后华南忍冬种植区在海南的合理布局具有重要的指导意义，而且对其他药材的合理布局也有一定的参考价值。在此基础上，今后更应加强基于更多种类分子标记的遗传分析、药材化学成分、气候因子关系的研究，以进一步深入探讨华南忍冬道地药材的

形成机理。

安徽农业科学                         2015年

参考文献

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