王彦丽 戚光祖等

[摘要] 目的 探讨经典的断裂点簇集区/Abelson白血病病毒（BCR/ABL）融合基因阴性骨髓增殖性肿（MPN）患者中钙网蛋白（CALR）基因突变的发生率，分析CALR基因突变阳性MPN的临床特点。 方法 依据2008年WHO造血组织和淋巴组织肿瘤分类标准对2012年1月～2015年3月在临沂市沂水中心医院就诊的72例临床初诊为“MPN”患者进行诊断时采用直接测序法检测CALR基因突变，采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）检测JAK2V617F突变。分析CALR基因突变阳性MPN的临床表现及实验室检查特点。 结果 在22例真性红细胞增多症（PV）患者中16例携带有JAK2V617F突变（突变率为68%），未检测出CALR基因突变；26例原发性血小板增多症（ET）患者中12例携带有JAK2V617F突变（突变率为46%），8例检测出CALR基因突变（突变率为31%），JAK2V617F突变阴性患者中CALR基因突变率为57%（8/14）；23例原发性骨髓纤维化（PMF）患者中11例携带有JAK2V617F基因突变（突变率为49%），8例检测出CALR基因突变（突变率为35%），JAK2V617突变阴性患者中CALR基因突变为为67%（8/12）。72例患者中均未检测到MPL515突变。 结论 CALR基因突变是JAK2V617突变阴性的MPN特异性分子标志物。将CALR基因突变检测纳入MPN诊断标准可以提高诊断的准确性减少漏诊率。

[关键词] 骨髓增殖性肿瘤； CALR基因；JAK2基因；突变

[中图分类号] R551.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（b）-0086-04

BCR/ABL1融合基因阴性的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative meoplasm，MPN）是一组起源于多能造血干细胞的恶性肿瘤，表现为骨髓细胞一系或多系过度增殖，包括真性红细胞增多症（polycythemia，PV）、原发性血小板增多症（essential thrombocthemia，ET）、原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF），临床上有发生动静脉血栓、髓外造血、骨髓纤维化、甚至向白血病转化[1-2]。JAK2V617F突变见于97%的PV，50%～60%的ET及PMF患者[3]。MPL515基因突变可见于3%～5%的JAK2V617F突变阴性的ET及PMF患者[4]。自2005年JAK2V617F和MPL515突变相继被发现并纳入WHO诊断标准，该突变的发现改变了MPN的诊断和分类，从分子的角度诠释了MPN的发病机制。但仍有40%的ET及PMF患者未检测到JAK2V617F基因突变，最近研究发现CALR见于JAK2V617F阴性的ET及PMF患者，本研究对临床初诊MPN患者进行了JAK2V617F、CALR及MPL515基因突变分析，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年1月～2015年3月在临沂市沂水中心医院就诊的72例初诊MPN患者。其中PV23例，男11例，女12例，年龄38～72岁；ET26例，男12例，女14例，年龄25～80岁；PMF23例，男16例，女7例，年龄39～76岁。所有患者均经医院伦理委员会批准并签署知情同意书。

1.2 检验指标

对患者临床资料、骨髓和外周血涂片、骨髓活检进行分析，按照WHO造血和淋巴组织肿瘤分类标准（2008）进行诊断。

1.3 方法

CALR基因突变分析：用血液基因组DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，生产商：Qiagen公司）提取骨髓细胞基因组DNA，CALR9号外显子PCR扩增引物（生产商：Invitrogen公司；使用浓度：5.0 pmol/μL；贮存条件：干粉于-20℃保存，工作液于4℃保存；有效期：-20℃为1年，4℃为半年），设计序列：引物名称：CALR-X9-Fwd，引物序列：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT；引物名称：CALR-X9-Rev，引物序列：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR体系包括DNA 50～100 ng，2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN公司产品）15 μL，正反向引物各0.5 μL，加去水离子补足体系至30 μL。反应条件：98°C预变性3 min，98°C变性10 s，63°C退火30 s，72°C延伸30 s，共29个循环，72°C延伸5 min。PCR扩增产物经回收、纯化后实验数据采用片段分析软件Genemapperid V4.1进行分析，分析示例见图1。

2 结果

2.1 72例MPN患者临床及实验室检查特点

根据2008年WHO分型诊断标准，PV 22例、ET 26例、PMF 23例、MPN-u 1例。所有患者均接受常规治疗至随访结束，患者均存活。在8例CALR突变的ET患者血小板计数高于JAK2突变阳性患者（表1）；8例CALR突变的PMF患者中7例为男性，发病年龄较小，且呈现出较低的白细胞计数、血红蛋白水平（表2）。

2.2 JAK2V617F、CALR及MPL515基因突变检测结果

22例PV患者中16例携带有JAK2V617F突变（突变率为68%），未检测出CALR基因突变；26例ET患者中12例携带有JAK2V617F突变（突变率为46%），8例检测出CALR基因突变（突变率为31%），JAK2V617F突变阴性患者中CALR基因突变率为57%（8/14）；23例PMF患者中11例携带有JAK2V617F突变（突变率为49%），8例检测出CALR基因突变（突变率为35%），JAK2V617突变阴性患者中CALR基因突变为为67%（8/12）。在72例患者中均未检测到MPL515突变。

3 讨论

CALR为Ca2+结合蛋白复合体，主要定位于内质网（edoplasmic reticulum，ER）腔内。CALR基因定位于染色体19p13.2～p13.3，包含9个外显子，大小为4.2 kb，其编码的CALR由高度保守近似球形结构的N端（1～180氨基酸残基）、参与ER内Ca2+储存的酸性c端（291～400氨基酸残基）及中间富含脯氨酸而形成的具伸出式结构的P端（181～290氨基酸残基）。3个结构域均具有各自特殊的功能，N端及P端主要发挥分子伴侣的作用，C端的作用主要为调节ER中的Ca2+浓度，保持细胞内Ca2+稳态，CALR基因缺失将减少ER内Ca2+的储存量。CALR C端的终点为ER滞留信号（KDEI）肽，KDEL可使CALR从高尔基体回到ER，阻止其分泌至ER外，具有靶向定位作用。多项研究发现CALR突变呈阳性MPN患者骨髓细胞中突变型CALR大部分定位于ER内[6]。同时，CALR介导的Ca2+稳态的调节可影响多种细胞功能，包括巨核细胞分化成熟及血小板的形成、整合素介导的信号转导、免疫应答、细胞凋亡、增殖及吞噬作用、介导伤口愈合及纤维化。早期研究证实BCR/ABL1阴性MPN患者存在JAK2V617突变。Kampfl等[6]和Nangalia等[7]采用外显子测序的方法在JAK2/MPL阴性的大部分标本中检测到CALR第9个外显子突变。并对大样本健康人群进行CALR目标基因检测，结果发现在健康个体对照组、淋巴系肿瘤、急性白血病及实体肿瘤中均未见CALR基因突变。结果提示CALR基因突变为JAK2及MPL基因突变阴性的ET及PMF的特异性分子标志物。因CALR基因突变均位于第9个外显子，本研究采用直接检测第9个外显子的方法在JAK2基因突变阴性的ET患者中检测到CALR突变率为57%；23例PMF患者中8例检测出CALR基因突变（突变率35%）；研究表明，CALR基因突变不会发生在PV患者中，本组22例患者中均未检测到CALR基因突变也证实了这一观点。2014年，Tefferi等[8]检测了576例ET患者中，CALR的突变率为15%；Rumi等[9]检测了745例患者，CALR的突变率为24%；Chi等[10]检测了289例患者，CALR的突变率为9%；Kim等[11]检测CALR突变率为12.6%。本实验中ET患者CALR的突变率为31%，在JAK2/MPL阴性的ET患者中突变率57%，而国内学者报道436例亚洲人CALR基因突变情况，CALR基因的突变率为22.7%，在JAK2/MPL阴性的ET患者中，其突变率为52.7%，本实验与国内报道相符。Rumi等[12]对CALR 突变呈阳性ET患者研究发现，极少数患者的CALR突变的等位基因负荷>75%，该结果推测ET的发生可能为杂合子克隆逐步积累，最终在骨髓中占据数量优势，特异性刺激巨核细胞导致。本研究显示CALR 突变患者均为杂合子。本研究中PMF患者CALR基因突变（突变率35%），与Langabeer等[13]报道的25%～35%的突变率相似。研究发现CALR突变与其临床表现和预后有重要的相关性。在ET和PMF患者中，CALR基因突变PMF患者较JAK2突变者血小板计数更高、年龄更小、血红蛋白更低，白细胞计数更低，PMF患者具有更好的生存率[14]，本研究中患者也具有以上临床特点。有文献报道发生CALR和JAK2突变者发生心血管事件的概率是13.4%和30.1%，10年血栓症累计发生率分别为5.1%和14.5%。在PMF患者中，Tefferi等[8]在254例标本中筛查了一些与MPN相关的基因突变，发现他们与CALR突变没有显著的分子或遗传学关联。Tefferi等[15]也报道在PMF患者中，发生1型CALR突变者比2型突变者有更好的预后。由本组实验可以看出，CALR是MPN中较易发生突变的基因，可将CALR突变检测纳入MPN诊断的常规指标。在临床上可以遵循以下思路考虑对MPN的诊断[16-20]：①由于CALR突变不发生在PV的患者，所以它不能用来筛查PV或PV后骨髓纤维化的疑似患者；②CALR、JAK2和MPL突变是互相排斥的，对已知发生了JAK2 或MPL突变的患者无需筛查CALR突变；③由于MPL突变率在三者中最低，对ET或PMF的疑似病例，应先行JAK2V617突变筛查，若阴性再行CALR突变筛查，CALR阴性则行MPL突变筛查。尽管CALR基因突变等为疾病的诊断提供了较为特异的分子指标，但仍有10%的ET和PMF患者需要结合骨髓病理检查结果加以诊断。

综上所述，CALR基因突变是JAK2V617F突变阴性的MPN特异性分子标志物。将CALR基因突变检测纳入MPN诊断标准可以提高诊断的准确性减少漏诊率。CALR基因突变的检测有助于JAK2V617F突变阴性的MPN的鉴别诊断，对CALR基因突变功能的进一步研究可望找到JAK2V617突变阴性MPN的分子治疗靶标。

[参考文献]

[1] Campbell PJ，Green AR. The myeloproliferative disorders [J]. N Eng J Med，2006，355（24）：2452-2466.

[2] Levine RL，Gilliland DC. Myeloproliferative disorders [J]. Blood，2008，112（6）：2190-2198

[3] 刘樱子.CALR基因突变在骨髓增殖性肿瘤中的进展[J].国际输血及血液学杂志，2014，37（6）：556-560

[4] Pikman Y，Lee BH，Mercher T， et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia [J]. PLoS Med，2006，3（7）：e270.

[5] 王婕妤，艾晓菲，徐俊卿，等.Ph染色体阴性骨髓增殖性肿瘤患者JAK2基因第12外显子突变研究[J].中华血液学杂志，2012，33（9）：705-709.

[6] Klampfl T，Gisslinger H，Harutyunyan AS，et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms [J]. Engl J Med，2013，369（25）：2379-2390.

[7] Nangalia J，Massie CE，Baxter EJ，et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2 [J]. N Engl J Med，2013，369（25）：2391-2405.

[8] Tefferi A，Lasho TL，et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative myelofibrosis：clinical，cytogenetic and molecular comparisons [J]. Leukemia，2014，28（7）：1472-1477.

[9] Rumi E，Pietra D，ferretti V，et al. JAK2 orCALR mutation status defines of essential thromboeythemia with substantially Different clinical course and outcomes [J]. Blood，2014，123（10）：1544-1551.

[10] Chi J，Nicolaidou V，Nicolaidou V，et al. Calreticulin exon 9 frameshift mutations in patients with thrombocytosis [J]. Leukemia，2013，28（5）：1152-1154.

[11] Kim SY，Im K，Park SN，et al. CALR，JAK2，and MPL mutation profiles in patients with four different subtypes of myelo-proliferative neoplasms：primary myelofibrosis，essential thrombocythemia，polycythemia vera，and myeloproliferative neoplasm，unclassifiable [J]. Am J Clin Pathol. 2015，143（5）：635-644.

[12] Rumi E，Pietra D，Ferretti V，et al. JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes [J]. Blood，2014，123（10）：1544-1551.

[13] Langabeer SE，Andrikovics H， Asp J，et al. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms [J]. Eur J Haematol EUR，2015.doi：10.1111/ejh.12578. [Epub ahead of print]

[14] Jones AV，Ward D，Lyon M，et al. Evaluation of methods to detect CALRmutationsinmyeloproliferativeneoplasms [J]. Leuk Res，2015，39（5）：530-535.

[15] Tefferi A，Lasho TL，Finke C， et al. Type 1 vs 2 calretieulin mutations in primary myelofibrosis：differences in phenotype and prognostic impact [J]. Leukemia，2014，28（7）：1568-1570.

[16] 谭栩，杨泽松，彭曦，等.原发性骨髓纤维化的治疗进展[J].疑难病杂志，2014，13（5）：542-545.

[17] 邢莉民，邵宗鸿.BCR/ABL阴性骨髓增殖性肿瘤血管新生的研究现状[J].中华医学杂志，2015，95（18）：1432-1434.

[18] 张群峰，刘维薇，关明，等.骨髓增殖性肿瘤的新分子标志物钙网蛋白基因突变[J].中华检验医学杂志，2014，（9）：649-652.

[19] 欧阳苑，乔纯，王菊娟，等.BCR-ABL阴性MPN患者CALR、JAK2及MPL基因突变分析[J].中华医学杂志，2015，95（18）：1369-1373.

[20] Tefferi A，Pardanani A. CALR mutations and a new dia-gnostic algorithm for MPN [J]. Nat Rev Clin Oncol，2014， 11（3）：125-126.

（收稿日期：2015-06-12 本文编辑：苏 畅）