尤耀东，黄晓朋，廖婷婷，俞旭君，陈晓洋，常德贵

八正散对腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR与Ki-67表达研究

尤耀东，黄晓朋，廖婷婷，俞旭君，陈晓洋，常德贵

目的：探讨八正散对腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR、Ki-67影响机制。方法：以腺性膀胱炎模型大鼠为研究对象，随机分为空白组、模型组、对照组、八正散高、中、低剂量组，对照组给予羟基喜树碱（3 mg/kg·d）给予膀胱灌注，八正散高、中、低剂量组分别给予同体积八正散液（生药浓度0.84、0.42、0.21 g·mL-1），每日2次，灌注/灌胃连续2周。HE染色观察膀胱病理变化，免疫组织化学法观察膀胱组织中的α1D-AR、Ki-67表达。结果：各组之间比较α1D-AR含量并无明显差异；与模型组比较，高剂量组、对照组能够下调Ki-67含量。结论：八正散可以有效改善腺性膀胱炎模型大鼠膀胱病变程度，推测与下调Ki-67含量有关。

腺性膀胱炎；八正散；α1D-AR；Ki-67蛋白

腺性膀胱炎（cystitis glandularis，CG）是一种较特殊的膀胱上皮增生性和化生性病变，随着人们生活方式和环境的改变，泌尿外科腔内技术的发展以及病理诊断技术的提高，CG的检出率呈逐年增高的趋势。临床CG发病率约为0.9%～1.9%［1］。多数研究者认为CG与膀胱癌之间有一定相关性，是膀胱尿路上皮癌的一种癌前病变［2］。CG已严重威胁着患者的健康。

1　仪器及试剂

1.1材料

成年雌性健康SD大鼠60只，体重（240±25）g，由成都中医药大学实验动物中心提供，生产合格证号：SCXK（川）2013-15。八正散煎剂按车前子、瞿麦、萹蓄、滑石、栀子、炙甘草、木通、大黄八味药各9g计；戊巴比妥钠5g（北京普博斯生物）；羟基喜树碱注射剂（规格5mL:5mg，哈尔滨三联药业有限公司，H20033506）；大肠埃希杆菌种（ATCC 25922上海北诺生物科技有限公司）。

1.2主要试剂及设备

Ki67蛋白抗体（批号：bs-2130R，兔多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司）；α1D-AR（批号：bs-1063R，兔多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司）；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（批号：13152A11）；辣根酶标记链霉素卵蛋白素（HRP/A-V）（批号：13152A11）；封闭用正常山羊血清（批号：13152A11）；显色剂：浓缩型DAB试剂盒（批号：K135925C），以上试剂来自北京中山金桥生物有限公司；全自动封闭式组织脱水机TSJ-Ⅱ型：（上海五相仪器仪表有限公司）；病理组织漂烘仪PHY-Ⅲ型（北京世纪科信科学仪器有限公司）；分光光度仪（博威兴业科技发展有限公司）等。

2　方法

2.1造模及给药

大鼠适应性喂养1周后，将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、对照组及八正散高、中、低剂量组各10只。参照易憬等［6］、位志峰等［7］造模方法。除空白组外，其余各组采用大肠埃希菌溶液（105～109CFU/100wL浓度），每隔2天灌注雌性SD大鼠膀胱以诱导产生腺性膀胱炎。45天后，空白组及模型组给予生理盐水灌胃，每日2次。对照组给予羟基喜树碱（3 mg/kg·d）给予膀胱灌注，八正散高、中、低剂量组分别给予同体积八正散液（生药浓度0.84、0.42、0.21 g·mL-1），每日2次，灌注/灌胃连续2周。

2.2观察及检测

2.2.1一般观察 每日巡查，观察并记录大鼠一般活动如饮食量、饮水量，大鼠毛色、粪便形状等。

2.2.1膀胱病理观察 灌注/灌胃2周后处死大鼠，观察大鼠膀胱大体情况，10%甲醛溶液固定膀胱组织。进行膀胱组织HE染色切片固定，在高倍镜视野下观察组织切片，记录并分析。

离衢州不远的南北群山，四十九军王铁汉部，七十四军王耀武部早已布下重兵，只等日军合围衢州，再来个南北夹击反包围，到那时，他陈颐磊的八十六军将来个中心开花，聚歼日军从华东、华北拼凑而来的十万骄兵。

2.2.2α1D-AR、Ki-67检测 采用S-P法，根据组织细胞膜、细胞浆或细胞间质等表达的不同颜色，来判断膀胱组织免疫组化表达情况，结果进行图像采集及分析。

2.3统计学分析

应用SPSS17.0 统计分析软件对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），数据以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1一般活动

造模各组大鼠均有不同程度的摄食减少，恶寒倦卧，反应迟钝，少动，毛发枯黄等现象。上述情况在八正散灌胃及羟基喜树碱灌注后逐渐开始改善。

3.2膀胱病理观察

空白组膀胱粘膜、肌层、浆膜三层完好，未见变性、坏死及炎细胞浸润，膀胱黏膜组织黏膜光滑，颜色均一淡红。模型组膀胱三角区及黏膜固有层大量炎细胞浸润，间质水肿，局灶性坏死，黏膜固有层内有Brunn巢及腺上皮化生。对照组膀胱黏膜固有层少量炎细胞浸润，间质轻度水肿，局灶性坏死，黏膜固有层内Brunn巢及腺上皮化生较模型组明显减少。高剂量组病变基本同药物组。中剂量组病变较模组有所减轻，但炎细胞浸润程度及黏膜固有层内Brunn巢及腺上皮化情况较灌药高剂量组略重。低剂量组病变基本同模型组。病理图示详见（图1）

3.3对α1D-AR、Ki-67的影响

表1　 八正散对大鼠膀胱组织α1D-AR、Ki-67平均光密度的影响（x±SD）

结果（表1，图2、3）显示：与空白组比较，模型组Ki-67显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，对照组及高剂量组Ki-67显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

4　讨论

传统中医并无CG一症，按临床表现，大多数学者将CG归属于中医“淋证”中热淋、湿热淋、血淋等范畴。核心病机总结为湿热蕴结，膀胱气化不利。临床显示，中医药在治疗CG方面特色明显，治疗原则上以清热利湿、利尿通淋为主。八正散源于《太平惠民和剂局方》，是目前治疗湿热淋证的常用经典方之一。方中集木通、滑石、车前子、瞿麦、萹蓄诸利水通淋之品，清利湿热。伍以栀子清泄三焦湿热，大黄泄热降火，甘草调和诸药而止茎中作痛，加少量灯心可导热下行。疏利下焦而不专于治下，清泻合法，组方用药侧重于苦寒通利。以清利膀胱为中心，并行清肺肃上源，降心火利小肠，泄湿热走大肠，有“疏凿分消”之巧。体外抗菌实验表明，八正散对于变形杆菌、大肠杆菌等均有一定的抗菌作用，对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌作用［8］。现代药理研究证实八正散组成诸药如萹蓄、瞿麦等皆具有不同程度的利尿和抗炎作用［9］。

目前比较统一的CG发病认知为CG的产生与慢性感染、尿路梗阻、排尿功能障碍等所导致的急、慢性膀胱内炎症密切相关。CG的临床症状常见以尿频、尿急为主的膀胱过度活动症（overactive bladder，OAB），与逼尿肌与尿道括约肌不随意收缩作用有关。肾上腺素能受体（adrenergic receptor，AR）是神经递质去甲肾上腺素和肾上腺素在靶细胞上的特异性受体，可分为α1、α2、β三类。其中α1-AR主要分布在逼尿肌、膀胱颈等，可使平滑肌收缩，产生排空效应；α1受体功能亢进时则可诱发膀胱逼尿肌不稳定，引起不稳定膀胱。Mally［10］研究发现人类膀胱逼尿肌上α1D-AR约占66%。CG患者膀胱逼尿肌层、三角区肌层α1D-AR表达增加，活性增强，可能是引起CG逼尿肌压升高、不稳定膀胱的原因之一［11］。通过测定实验各组对大鼠膀胱组织α1D-AR平均光密度的影响，结果显示药物组及八正散组α1D-AR含量与空白组并无明显差异。Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原，可以准确反映细胞增殖活性，是目前应用最广泛的细胞增殖标志之一［12～13］。临床研究显示定期膀胱灌注化疗，可以使膀胱组织中Ki-67含量下调［14～17］。不同类型腺性膀胱炎膀胱镜下Ki-67基础表达率明显不同。Ki-67阳性表达率越高，与正常膀胱黏膜差异性越大［18～20］。通过检测Ki-67在膀胱组织的表达情况，来判断临床膀胱癌的发生、发展、预后等情况［21］。表3结果显示八正散、羟基喜树碱能够下调Ki-67含量。本课题改善大鼠一般情况及病理，可能与下调Ki-67表达相关。

通过本课题研究，我们发现八正散能够改善腺性膀胱炎大鼠一般情况及大鼠膀胱病理性改变。但并不能下调膀胱组织α1D-AR含量，对逼尿肌功能作用可能通过其他途径，有待进一步深入研究。此外，药物组、八正散灌高组能下调Ki-67含量，下调含量程度与八正散的浓度呈正相关量效关系。实验证实八正散能够抑制腺性膀胱炎模型大鼠细胞增殖活性，八正散最佳治疗剂量有待我们进一步深入研究。

［1］Delnay K M，Stonehill W H，GoldmanH，et al. Bladder histological changes associated with chronic indwelling urinary catheter［J］. JUroU999，161（4）:l106.

［2］Tong R S，LamerT，inlayM，et al. Pelvic lipomatosis associated with proliferative cystitis occurring in two brothers［J］. Urology，2002，59（4）:602.

［3］梁勇，刘建辉，黄凤鸣，等.120例腺性膀胱炎的诊断和治疗［J］.第三军医大学学报，2008，30（3）:266.

［4］曾伟，陈志强，叶章群.下尿路感染与腺性膀胱炎关系的临床研究［J］.临床泌尿外科杂志，2004（6）:350.

［5］潘英.八正散加减治疗膀胱炎35例观察［J］.实用中医内科杂志，2006，20 （1）:85.

［6］易憬，熊飞，苏良平，等.SD大鼠腺性膀胱炎动物模型的建立［J］.临床外科杂志，2008，16（8）:553.

［7］位志峰，陈志强，叶章群.膀胱内灌注脂多糖建立腺性膀胱炎动物模型的研究［J］.临床泌尿外科杂志，2006，21（12）:933.

［8］朱雪琼，朱建龙，林希，等.八正散加减治疗腺性膀胱炎疗效观察［J］.中医药学报，2010，38（1）:99.

［9］袁海鑫，辛士永，史海军.八正散合桃核承气汤治疗Ⅲ型慢性前列腺炎的临床研究.［J］.光明中医，2014，29（4）:727.

［10］Granados E A，Algaba F，Vicente Rodriguez J. Cystitis glandularis［J］. Arch EspUrol，2009，52（2）:119.

［11］FerrandinaG，RanellettiFO，LaroccaLM，et al.Tamoxifenmodulales the expression of Ki67，apoptosis，and microvessel density in cervical cancer［J］.Clin Cancer Res，2001，7（9）:2656.

［12］Kruse AJ，BaakJP，JanssenEA，et al.Ki67 predicis progression in early CIN: validation of a multivariate progression-risk model［J］.Cell Oncol，2004，26（1-2）:13.

［13］Kruse AJ，BaakJP，JanssenEA，et al.Ki67 predicis progression in early CIN: validation of a multivariate progression-risk model［J］.Cell Oncol，2004，26（1-2）:13.

［14］DuchrowM，GerdesJ，SchluterC，et al.The proliferationassociated Ki67 protein:defi nition in molecular terms［J］.Cell Prolif，1994，27（5）:235.

［15］倪少滨，陈起引，邓索.P53和bcl-2在腺性膀胱炎及膀胱癌组织中的表达与意义［J］.中华外科杂志，2004，42（8）:500.

［16］方海伟，程跃，蒋军辉，等.p53、ki67肿瘤标志物在不同分型腺性膀胱炎中的表达及临床意义［J］.中国中西医结合外科杂志，2010，16（2）:183.

［17］陈志强，位志峰，叶章群，等.腺性膀胱炎中肿瘤相关指标的改变和临床分型的探讨［J］.中华医学杂志，2005，86（26）:1842.

［18］何屹，张志根，丁伟，等.腺性膀胱炎CK20、Ki-67表达意义的研究［J］.临床医学，2007，27（9）:79.

［19］Fechner G，Perabo G，Schmidt DH，et al.Preclinical evaluation of a radiosensitizing effect of gemcitabine in p53 mutant and p53 wild type bladder cancer cells［J］.Urology，2003，61（2）:468.

［20］Malmstrom PU，Ren ZP，Sheriff A，et al.Early metastatic progres sion of bladder carcinoma:molecular profile of primary tumor and sentinel lymph node［J］.J Urol，2002，168（5）:2240.

［21］Rau AR，Kini H，Pai RR.Morphological evaluation of cystitis glandularis［J］.Indian J PatholMicrobiol.2009，52（2）:203.

［22］张海峰，郑国有，杨立新.p53、Ki-67基因表达与膀胱癌生物学特性的研究［J］.中国老年学杂志，2005，7（29）:1744.

（责任编辑：陈思敏）

The infl uence of Bazheng San on α1D-AR and Ki-67 expression of rats with cystitis glandularis

YOU Yao-dong, HUANG Xiao-peng, LIAO Ting-ting, YU Xu-jun, CHEN Xiao-yang, CHANG De-gui
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan)

［Abstract］Objective: To study the infl uence mechanism of Bazheng San on α1D-AR and Ki-67 in rats with cystitis glandularis（GC）. Method: GC rat was used and divided into blank group，model group，control group，high，medium and low dose of Bazheng San group. 3mg/kg·d hydroxycamptothecine （HCPT） were given by irrigation of bladder administration to control group. High，medium and low dose （0.84，0.42、0.21 g·mL-1） of Bazheng San group were given Bazheng San by intragastric administration 2 times a day for 2 weeks. Histopathological change of bladder was observed with HE. The expression of α1D-AR and Ki-67 of GC rats bladder was observed with immunohistochemistry. Results:The content of α1D-AR in bladder tissues from CG rats showed no obvious difference among all groups. And immunofl uorescence data revealed that Ki-67 content in the bladder tissues of GC rats in high dose treatment group and control group were down-regulated signifi cantly compared with models. Conclusion: From the experiment we suggest Bazheng San can ameliorate the bladder pathological change in CG rats bladder by reducing the Ki-67 content.

Glandular cystitis； Bazheng San； α1D-AR； Ki-67

R 285.5

A

1674-926X（2015）06-011-03

四川省教育厅科技项目（13ZB0317）；成都中医

药大学科技发展基金项目（030018007）

成都中医药大学临床医学院，四川 成都 610075［作者简介］尤耀东，讲师，主要从事中西医泌尿男科临床与

基础研究

Tel:18908170788Email:yyd110@163.com

常德贵，主任中医师，主要从事中西医泌尿男科

临床与基础研究

Tel:18980880133Email:cdg998@sina.com

2015-08-13