向志芸，李小芳，罗开沛，罗佳，杨露，林浩，刘海霞

正交试验设计法优选龙胆中龙胆总苷的提取工艺

向志芸，李小芳，罗开沛，罗佳，杨露，林浩，刘海霞

目的：采用正交试验设计法优化龙胆中龙胆总苷的提取工艺。方法：通过预实验和单因素试验，最终选用回流提取法，并以乙醇浓度、乙醇的体积、提取时间为自变量，龙胆总苷的百分含量为因变量，采用 L9（34） 正交试验设计最终确定龙胆的最佳提取工艺。结果：龙胆的最佳提取工艺为：60%的乙醇提取3次，乙醇用量为12倍，提取时间为第1次2小时，第2次1小时，第3次1小时。龙胆总苷的百分含量能达到8.73%。结论：正交试验设计法优化龙胆中龙胆总苷的提取工艺，环保，能耗低，方法简便，提取效率高，预测性良好。

龙胆；龙胆总苷；正交试验设计

龙胆（Gentiana chinensis）为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag、龙胆Gentian.a scabra Bge.、三花龙胆Gentiana trifl ora Pall.或滇龙胆Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根茎。前三种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”。具有清热、泻肝、定惊之功效。据本草纲目［1］记载，因其叶如龙葵，味苦如胆，因此而得名。根据化学成分研究表明，龙胆苦苷（gentiopicroside，GTP）是龙胆科植物龙胆、秦艽等的活性最强的有效成分之一［2］。现代药理研究证明龙胆苦苷具有对多种肝损伤具有显著地保护作用，还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛的作用，具有非常重要的开发价值［3］。为更好的开发利用它，本研究通过紫外-可见分光光度法及正交试验设计法优选龙胆总苷的提取工艺，为龙胆总苷的有效开发利用、工业化生产和剂型研究提供实验依据。

1　仪器与试药

UV-6100型紫外可见分光光度计，PS-60A型超声波清洗器，BP-61 电子天平，B-260恒温水浴锅，Q-250B3型高速多功能粉碎机，龙胆饮片购于四川新荷花中药饮片股份有限公司 （ 批号: 1111044，产地：云南），粉碎至粗粉，备用。龙胆苦苷对照品购于成都曼思特生物科技有限公司（ 批号: MUST-14081205），其他试剂均为分析纯。

2　方法和结果

2.1方法学考察

2.1.1对照品溶液的制备 将龙胆苦苷对照品置于五氧化二磷干燥器中干燥12 h以上，于十万分之一天平精密称取0.00328 g置25 mL棕色容量瓶中，先用l0 mL 70%乙醇溶解，再加乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2供试品溶液的制备 取龙胆药材粗粉（过5号筛）1 g，用10倍量70%乙醇80 ℃加热回流提取1.5 h，提取液过滤，再用8倍量70%乙醇加热回流提取1.5 h，提取液过滤，合并滤液，备用。

2.1.3最大吸收波长的确定 分别取一定浓度的龙胆苦苷对照品溶液和供试品溶液在200～800 nm范围进行波长扫描，结果对照品和供试品均在274 nm处有较强吸收，故选择274 nm为最大吸收波长。

2.1.4标准曲线的绘制 以龙胆苦苷为标准物，精密吸取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0mL、3.5 mL于容量瓶中，得龙胆苦苷浓度为6.56 g·mL-1、13.12 g·mL-1、19.6 g·mL-1、26.24 g ·mL-1、32.8 g·mL-1、45.92 g·mL-1的溶液，以70%乙醇稀释至刻度，用紫外分光光度计在274 nm处，以70%乙醇为随行空白，测定吸光度，所得结果以龙胆苦苷溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作线性回归，得回归方程为Y=0.0192X+0.0114，（r=0.9991），对照品浓度在6.56 g·mL-1～45.92 g· mL-1范围内线性关系良好。

2.1.5精密度试验 取同一对照品溶液，以70%乙醇为随行空白，在所确定波长处测定吸光度，连续测定五次，吸光度分别为：0.400、0.401、0.401、0.400、0.401，得RSD=0.14%，结果表明，龙胆苦苷进样精密度良好。

2.1.6样品溶液的稳定性试验 取同一供试品溶液在室温下放置，分别于0、4、8、12、24、48 h进样测定，统计测得浓度的RSD值。结果表明，供试品溶液室温下2 d内稳定，RSD为0.2%，表明样品稳定性良好。

2.1.7重复性实验 取同一龙胆样品5份照“2.1.2”项下制备方法制备样品溶液进行试验，测定每份样品中龙胆苦苷的百分含量。RSD为1.2%，表明该方法的重复性良好。

2.1.8加样回收率试验 精密称取同一批己知含量的龙胆药材粉末9份，每份约100 mg，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入GTP对照品溶液，制备供试品溶液，测定龙胆苦苷的含量，计算高、中、低3种质量浓度的平均回收率及RSD，分别为101.2%（RSD=0.23%）、99.8%（RSD=0.41%）、98.4%（RSD=0.50%），平均回收率为99.8%，RSD为 0.38%，说明该方法回收率良好。

2.2提取方法筛选与单因素考察

为了保证实验操作方便可行以及实验结果精确，以龙胆苦苷的百分含量为指标，先进行提取方法的筛选，在此基础上在进行单因素的考察。

2.2.1提取方法的筛选 超声提取:取龙胆药材粗粉（过5号筛）1 g，加10倍量70%乙醇，超声提取30 min，过滤，再加8倍量70%乙醇，超声提取30 min，过滤，合并滤液，备用。

加热回流提取：取龙胆药材粗粉（过5号筛）1 g，用10倍量70%乙醇80 ℃加热回流提取1.5 h，提取液过滤，再用8倍量70%乙醇加热回流提取1.5 h，提取液过滤，合并滤液，备用。

冷浸提取：准确称取龙胆药材粗粉（过5号筛）1 g，加l0倍量70%乙醇，冷浸12 h，再加8倍量70%乙醇，冷浸12 h，抽滤，合并滤液，备用。

将上述所得的3种提取液定容，测定龙胆苦苷的百分含量分别为5.87%、6.47%、6.10%。由实验结果可知，回流提取法提取效果较好。

2.2.2单因素实验考察 分别考察了乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、乙醇体积（8、10、12、15、20倍）、提取时间（1h、2h、3h、4h）、提取次数（1、2、3、4次）等因素对提取龙胆苦苷的影响，有实验结果可知：提取溶媒乙醇浓度在60%～80%时，提取效果较好；提取溶剂用量为12倍、15倍、20倍时，GTP提出量显著高一些；提取2 h以上时，GTP提出量差别不大；提取3次是最适宜的。

2.3正交试验设计

根据单因素实验考察结果，选择对实验结果影响较大的3个因素即乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）、提取时间（C）为考察因素，提取物中GTP的百分含量（Y）为考察指标，采用L9（34）正交表，进行4因素3水平设计，因素水平表见表1。精密称取龙胆药材粗粉1 g，按正交表依次进行实验，提取次数为3次，所得溶液滤过，用紫外分光光度计测定所含龙胆总苷的含量。正交试验安排见表2，方差分析结果见表3。

表1　正交设计因素水平表

表2　正交实验安排表

表3　方差分析表

由极差分析结果可见，影响龙胆苦苷百分含量的因素顺序为提取时间＞提取浓度＞溶剂用量，P（A）＜0.05，P（C）＜0.05，说明提取浓度和提取时间为重要因素，P（C）＞0.05，说明提取溶剂的倍数的影响没有统计学意义，可任选。因此，综合考虑生产实际，尽量节约成本，确定龙胆最优提取方案应为：60%的乙醇提取3次，溶剂用量12倍，提取时间为第1次2小时，第2次1小时，第3次1小时。

按优化得到的加热回流提取工艺重复提取三次，计算GTP提出量结果分别为8.54%、8.64%、9.02%，结果表明该加热回流提取工艺重现性良好，工艺稳定可行。

3　讨论

龙胆苦苷作为龙胆的主要活性成分，具有显著的抗肝损伤、抗病毒、抗炎作用，具有重要的开发价值。但是龙胆苦苷的提取率低严重阻碍了其开发利用，本研究旨在通过单因素试验及正交试验优选出其最佳提取工艺，为龙胆苦苷的生产及其开发利用提供实验参考。

［1］ 现代本草纲目［M］. 北京:中国医药科技出版社，2001.

［2］杨书彬，王承. 龙胆化学成分和药理作用研究进展［J］. 中医药学报，2006，33（6）: 54.

［3］刘占文，陈长勋，金若敏，等. 龙胆苦苷的保肝作用研究［J］.中草药，2002，33（1）: 47.

（责任编辑：傅舒）

Study on the extraction technology of total gentiin in Longdan by orthogonal design method

XIANG Zhi-yun, LI Xiao-fang, LUO Kai-pei, LUO Jia,YANG Lu, LIN Hao, LIU Hai-xia
(Chengdu University of TCM; Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese herbal medicines;System of traditional Chinese medicine resources and Development Utilization of Ministry of State Key Laboratory Breeding Base, Chengdu 611137, China)

Objective: To optimize the extraction technology of total gentiin in Longdan using orthogonal design method. Method: Pre-test and one-factor test were carried to optimize the technology and refl ux extraction was selected. Ethanol concentration，ethanol volume and extraction time were used as independent variables，the percentage of total gentiin was used as the dependent variable. L9（34） orthogonal experimental design was applied to ultimately determine the best extraction process. Result: The optimal extraction process of gentian was as follows: 60% ethanol，extract three times（2h，1h，and 1h each time） ，12 times of ethanol. Total gentiin percentage was 8.73%. Conclusion: The extraction process of total gentian optimized by orthogonal design is environmental with low energy consumption. The method is simple，and the extraction effi ciency is high with good predictability.

Longdan；total gentiin ； orthogonal design

R 283.3

A

1674-926X（2015）06-008-03

成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

向志芸，女，硕士研究生，从事中药新剂型及中药新技术研究

Tel:18380228578Email:498939565@qq.com

李小芳，女，教授，博士生导师，从事中药新剂型及中药新技术研究

Email:lixiaofang918@163.com

2014-04-16