杜珊珊，王颖，张东杰

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

中性蛋白酶是一类在中性pH 条件下作用于蛋白质肽键的蛋白酶[1]，其能将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸[2]，具有广泛的市场价值，被应用于纺织、医疗、皮革、食品等行业[3-4]，但中性蛋白酶产量低，成本高，发酵不稳定等，为了提高酶活性，世界各国科研工作者主要在蛋白酶基因的筛选，基因序列[5-6]，克隆表达[7]等方面进行研究。比如杨庆云等[8]用鸟枪法克隆得到嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶基因，该基因表达量提高了约30 倍。茆军等[9]成功克隆了高温中性蛋白酶基因，并在毕赤酵母中正确表达。

此前对中性蛋白酶的研究主要集中在蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，而对解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶的研究相对较少。解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，与枯草芽孢杆菌具有很近的亲缘关系[10-11]，它具有较强的胞外酶分泌能力，是淀粉酶、蛋白酶的一些主要酶制剂的生产菌株[12]。研究以中性蛋白酶生产菌株解淀粉芽孢杆菌为研究对象，利用基因工程技术对其中性蛋白酶基因进行了克隆表达，获得了具有一定活性的中性蛋白酶。

1 材料与方法

1.1 材料

解淀粉芽孢杆菌购自中国工业菌种保藏管理中心，E.coli BL21（DE3）与质粒PET-28a 由实验室保存，Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、T4-DNA 连接酶购于大连TaKaRa 产品，IPTG（异丙基-β-D 硫代半乳糖苷）、DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒DNA 小提中量试剂盒购自北京博大泰克生物有限公司。……