刘丽英 曲文玉 孔刚 张晓丽 刘晓丽

三种染色方法检测冻融后兔卵巢组织的活力和质量

刘丽英 曲文玉 孔刚 张晓丽 刘晓丽

目的 建立一种简单的评价冷冻前后卵巢组织活力与质量的方法。方法 10只性成熟雌性大耳白兔，取卵巢组织制成皮质片，随机均分成2组（n=5）：新鲜组织和冷冻组织。台盼蓝、Calcein AM/EH及中性红染色检测分离卵泡的存活率并对卵巢组织中卵泡的存活情况进行染色。激素释放试验检测冷冻前后兔卵巢组织的功能。结果 应用台盼蓝、Calcein AM/EH及中性红对卵巢组织分离卵泡活力的评价效果相似；中性红能较好的评价卵巢组织中卵泡的存活情况。经冷冻解冻后，卵泡的活力下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；体外培养过程中，培养液E2水平不断增加，培养12d后，E2浓度在新鲜及冷冻复苏组织分别达1054、961pg/mL。孕酮水平分别为2.31、1.9ng/mL。结论 中性红可有效地评价卵巢组织卵泡的活性；激素释放试验可以提供冷冻解冻卵巢组织存在活性的佐证。

冷冻保存；卵巢组织；台盼蓝；中性红

卵巢是女性的性腺，其主要功能有：产生卵子并排卵的生殖功能及产生性激素的内分泌功能。自然情况下，随着年龄的增长，女性生殖能力逐渐下降是正常的、不可避免的。但对于患恶性肿瘤的女性患者(尤其是儿童和青春期前)来讲，抗肿瘤治疗：如大剂量化疗和放疗、妇科根治性手术治疗(切除性腺)等都会对部分性腺功能产生严重的损伤，甚至是丧失，对患者的生活质量和生殖能力造成严重的影响。目前已经出现多种保存女性生育力的方法：一些团队试图富集卵子进行冷冻保存[1]，而其他一些团队则在卵巢冷冻方面进行研究[2]。动物实验表明，大鼠、小鼠及家兔的卵巢组织经冷冻、解冻及自体移植能够获得妊娠[3-4]。同时卵巢的冷冻及自体移植还能够恢复患者的内分泌功能。

冷冻卵巢组织结构的完整性及卵泡活力的评价方法有：组织学评价（光镜及电镜）及活细胞染色。卵巢组织功能的评价方法有激素释放试验及卵巢组织的移植试验。本研究的目的在于应用上述方法对兔的卵巢组织进行冷冻前后的评价，以为人类的卵巢组织冷冻提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 卵巢组织皮质片的制备 4～5个月龄清洁级性成熟雌性大耳白兔10只，体质量2～2.5kg，由中国医科大学实验动物中心提供。经兔耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠溶液(2mL/kg)。麻醉动物后行下腹正中切口，切取卵巢组织。去除卵巢组织周围的脂肪组织、系膜以及血渍，室温下采用PBS液反复冲洗。用刀片切除髓质部分，仅保留卵巢皮质，切割成1mm×5mm×5mm大小的组织块，整个切割过程15min内完成，将组织分为新鲜组织（对照组）和冷冻组织（实验组）。

1.2 卵巢组织的冷冻与解冻 卵巢组织块装入含6mL的卵巢冷冻液中（含10%胎牛血清、1.5mol/L乙二醇,PBS），4℃摇床平衡30min，装入1.8mL的细胞冻存管，置于Planner程序降温仪中。－2℃～－9℃，2℃/min，－9℃～－40℃，0.3℃/ min，－40℃～－140℃，－10℃/min，－9℃植冰，冷冻曲线保存于计算机中，冻存管转移至液氮保存。

解冻：37℃解冻，依次经过解冻液1、2、3（解冻液1含0.75M EG，0.25M S，PBS，10%胎牛血清；解冻液2含0.25M S，PSB，10%胎牛血清；解冻液3含PBS，10%胎牛血清）各10min，室温轻轻震荡，去除冷冻保护剂。

1.3 卵泡的分离及染色

1.3.1 卵泡的分离 将新鲜及冷冻解冻的卵巢组织移到Mcllwain切片机垫板上，切至卵巢组织大小约为0.5mm×0.5mm ×0.5mm。将切碎的卵巢组织移至含Liberase blendzyme（终浓度为0.04mg／mL）的50mL离心管中，37℃水浴中轻微震荡60min，每10min用巴氏吸管轻轻吹打，胎牛血清终止消化反应。悬浊液500转，4℃离心10min，去上清，将沉渣转移至培养皿，体式显微镜下观察卵泡。用130μm内径的巴氏吸管将卵泡一个接一个吸出来，放在盛有含10%胎牛血清(FBS)的PBS的培养皿中，洗涤3次，将肉眼所见的间质细胞全部去除。

1.3.2 台盼蓝试验 卵泡应用0.4%台盼蓝染色约1min。倒置显微镜下观察（×400倍），卵泡中≥10%的颗粒细胞及卵母细胞蓝染为异常卵泡。卵母细胞不着色且仅＜10%的颗粒细胞着色表示为正常卵泡。

1.3.3 Calcein AM/Ethidium homodimer-1染色 在培养液滴中加入等体积的2×Calcein AM/Ethidium Homodimer-1工作液混匀，37℃避光染色45min，荧光显微镜下观察（激发波长/发射波长分别为（495/515nm）和（495/635nm）），观察存活卵泡(绿色荧光)和死亡卵泡(红色荧光)，计算存活卵泡的百分比。

1.3.4 中性红染色 卵泡应用15μg/mL的中性红染色，倒置显微镜下观察（×400倍），卵泡中卵母细胞及＞90%颗粒细胞着色的为存活卵泡。

1.4 卵巢组织中卵泡活性的染色 新鲜及冷冻复苏的卵巢皮质组织用组织切片机切割，将卵巢组织移到Mcllwain切片机垫板上，将卵巢组织切至泥状，分别应用台盼蓝、Calcein AM/ EH及中性红进行染色，倒置显微镜下观察。

1.5 激素释放试验 将冷冻前后的卵巢皮质片转移到含有lmL卵泡培养液[含1%胰岛素转铁蛋白硒（Its），100mIU/mL的卵泡刺激素（FSH），10mIU/mL的黄体生成素（LH），5%胎牛血清（FCS）的α-MEM]的35mm培养皿中，37℃，5% CO2培养24h半量换液，收集培养液冻于-80℃冰箱中待用。解冻冷冻保存的培养液，采用电化学发光免疫分析法测定雌二醇及孕酮水平。试剂盒购买于德国罗氏公司，电化学发光免疫分析仪购买于瑞士Roche公司，按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据的统计分析。样本率的比较采用Fisher's确切概率法或χ2检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 冷冻对卵巢组织内分离卵泡的影响 在倒置显微镜下观察，新鲜卵巢组织分离获得的窦前卵泡大部分呈圆形或卵圆型，有完整的颗粒细胞层。卵母细胞位于卵泡的中间或略偏一侧，镜下表现为圆而明亮，胞质均匀；颗粒细胞层周围光滑。见图1A。冷冻复苏后的兔卵巢组织经分离获得的部分窦前卵泡与新鲜卵巢组织分离获得的窦前卵泡形态相似，部分卵泡表现为颗粒细胞层模糊或破损，变形或崩解。卵母细胞色泽暗淡，模糊不清。见图1B。

卵泡经双荧光染色后，在蓝光的激发下，活细胞显示绿色荧光，死亡细胞显示红色荧光；卵泡经台盼蓝染色后，蓝染的为死亡卵泡，不着色的为存活卵泡；卵泡经中性红染色后红染的为存活卵泡，不着色的为死亡卵泡。见图2。冷冻前后卵泡存活率的比较见表1。

表1 冷冻前后兔分离卵泡的存活率比较

3种染色方法对冷冻前后兔卵巢组织分离卵泡的染色结果提示，台盼蓝、Calcein AM/EH与中性红给出了相似的卵泡存活率，差异无统计学意义。冷冻复苏组织的卵泡存活率低于新鲜组织，差异有统计学意义(P＜0.01)，可见在冷冻及卵泡分离过程中受到一定的损伤。

图1 分离冷冻前后窦前卵泡的形态

图2 3种染色方法进行分离卵泡的染色结果

2.2 卵巢组织中卵泡活性的检测结果 卵巢组织中卵泡的染色结果显示，台盼蓝仅能检测死亡卵泡的情况，不能检测卵巢组织中存活卵泡的数量，不利于移植前卵泡状态的评估。Calcein AM/EH不能检测卵巢组织中卵泡的存活情况，中性红作为活细胞染料可以很好的检测卵巢组织中卵泡的存活情况，有利于移植前的卵巢组织卵泡状态的评价。见图3。

图3 中性红检测卵巢组织中卵泡的存活情况

2.3 激素释放试验 为了排除卵泡培养液内存在相关激素的可能性，对新鲜的卵泡培养液的激素水平进行测定：17-β雌二醇（E2）＜10pg/mL，孕酮＜0.1ng/mL。卵巢皮质片经培养12d后，其E2浓度在新鲜及冷冻复苏组织分别达1054、961pg/ mL。孕酮水平分别为2.31、1.9ng/mL。见图4。

3 讨论

放疗和化疗技术的进展，极大地提高了年轻肿瘤患者的生存率，然而这些治疗对生育力的影响是致命的[5]。由于社会及经济因素的影响，目前选择晚育的女性不断增加,因此在诊断为肿瘤时，要求保存生育力的育龄妇女数量不断增加。卵巢组织的冷冻保存对于生育力保存是一个很有前景的方法[6]，它不需要卵巢刺激和供精；卵巢组织冷冻对于青春期前的女孩是仅有的一种生育力保存方法；同样也适用于不能接受卵巢刺激而推迟肿瘤治疗的单身女性。在这一过程中，卵巢组织通过外科手术切除，去除髓质及黄体，仅留薄薄一层皮质（约1mm）冷冻保存。经过冷冻，大多数存活下来的卵泡是小的原始卵泡，这些原始卵泡代谢不旺盛，缺少透明带、纺锤体和皮质颗粒细胞，比成熟的卵泡较易耐受冷冻损伤，是卵巢组织冷冻保存的主要对象。事实上，卵巢组织冷冻保存已开始被作为一种治疗手段。但它仍然存在很多的问题：一个主要问题是如何简单地评价冷冻卵巢组织的活力和质量。本研究应用3种染色方法检测冻融前后兔卵巢组织分离卵泡的存活率、激素水平测定评价卵泡的功能。

图4 冷冻前后分离卵泡经体外培养E2及孕酮值的变化

目前卵巢组织尚无公认的冷冻方案，将冻融后的卵巢组织分离出单个卵泡并检测其活性，能够间接检验冷冻方案是否达到满意的冷冻效果。本研究主要比较3种染色方法（台盼蓝、Calcein AM/EH-1、中性红）对分离卵泡活力的检测能力。台盼蓝作为一种排除实验，不穿透细胞膜完整的活细胞，而能通过死亡卵泡的卵泡膜使卵泡内的卵母细胞和颗粒细胞染色。钙黄绿素(Calcein AM)/溴乙非啶同型二聚体(Ethidium homodimer-1，EH-1)双荧光染色是目前公认的检测卵泡的存活状况的指标,Ethidium homodimer 1能插入DNA中，将膜溶解卵泡的细胞核染成红色，Calcein AM是非荧光物质，但通过细胞膜后，被溶酶体内的细胞酯酶转化为强荧光物质Calcein，产生绿色荧光。因此通过对于卵泡的Calcein AM/EH-1的双荧光染色，可以判断卵泡是否存活。中性红能够穿透细胞膜，将膜完整的细胞染成红色。这3种方法给出了冷冻前后活力的比较，组织学评价确证了这一结果。本研究结果表明，台盼蓝与中性红提供了与CalceinAM/ EH-1相同的信息，而价格却是它的1/100。卵巢皮质片中卵泡的染色结果显示，台盼蓝及Calcein AM/EH不能检测卵巢组织中卵泡的存活情况，中性红作为活细胞染料可以很好地检测卵巢组织中卵泡的存活情况，有利于对移植前卵巢组织存活卵泡的数量进行评价。

本研究结果显示，新鲜卵巢组织的卵泡存活率为84.2%，考虑仍有部分卵泡在前期运输，修整卵巢组织块时的机械切割和挤压及分离卵泡过程中使得卵巢组织中的部分卵泡损伤。

冷冻复苏后培养卵巢皮质片的激素活性测定是评价冷冻方案有效性的一个标准。众所周知，卵巢组织生成类固醇的活性是卵巢活性的一个附加指标。本研究发现，新鲜培养组和冷冻复苏培养组均有E2的分泌，E2的产量随着培养时间的延长而增高，提示冻融后组织具有体外发育潜力，并保持了一定的内分泌功能，本研究的结果与文献报道的相似[7]。但需要指出的一点是：我们培养的是卵巢皮质片，而不是分离的卵泡，所以类固醇产生不仅仅反映卵泡的发育情况，有研究表明[8]，取自绝经期卵巢皮质片中增生的基质细胞也能在在体或离体的情况下产生E2。Isachenko等[9]应用玻璃化冷冻和体外培养人的卵巢皮质片发现，尽管在新鲜和培养的皮质片中没有检测到卵泡,孕酮的水平仍然与对照组一样高。因此冷冻卵巢组织的内分泌功能与生殖功能之间的关系值得进一步的研究。

冷冻卵巢组织的主要目的是自体移植后恢复患者的生育能力及内分泌功能。那么，移植前正确评价冷冻组织卵泡的存活及内分泌功能是至关重要的。本研究表明，应用便宜的染料台盼蓝和中性红染色可以评价分离卵泡的活力，同时中性红也可直接用于卵巢皮质片中存活卵泡的染色，更适用于移植前卵泡活力的检测。激素释放试验可以间接地检测卵泡的功能，提供冷冻效果的信息。

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Objective To establish a simple evaluated methods to assess the vitality and quality of ovarian tissue after freezing-thawing procedures. Methods Ovarian tissues from 10 female rabbits were randomly divided into two groups: fresh group and frozen group. The follicles viability were assessed by trypan blue staining,calcein AM/ethidium homodimer-1 staining and neutral red staining. The function of ovarian tissues were detected by hormone-releasing assays. Results Trypan blue, Calcein AM/EH and neutral red staining have the similar results about ovarian follicle viability assessment. The viability of follicles decreased after freezing and thawing (P＜0.05); E2and Progesterone levels increased after cultured 12 days. The supernatants showed 17-βestradiol concentrations of 1054 and 961pg/mL, and progesterone concentrations of 2.31 and 1.9ng/ mL respectively in fresh and frozen groups. Conclusion Neutral red staining can effectively evaluate the follicle viability; Hormone-releasing test can provide the evidence that the freezing-thawing ovarian tissue has higher developmental potential.

Cryopreservation; Human ovarian tissue; Trypan blue; Neutral red

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.27.001

沈阳市科委项目(F14-158-9-13)

辽宁 110014 沈阳市妇婴医院生殖中心 （刘丽英 曲文玉 孔刚张晓丽 刘晓丽）