王征帆，杨艳丽，孙晓霞，刘霞，齐春梅，李莎（.渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南74000；.陕西国防工业职业技术学院热能化工系，陕西西安7030）

华州山药提取物对两种自由基清除试验研究

王征帆1，杨艳丽2，孙晓霞1，刘霞1，齐春梅1，李莎1
（1.渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000；2.陕西国防工业职业技术学院热能化工系，陕西西安710302）

摘要：为了进一步开发利用山药资源，以无水乙醇和水分别为溶剂提取了陕西华县产华州山药的活性成分，对其乙醇提取物和水提取物清除羟基自由基、DPPH自由基的能力进行了测定。结果表明，山药样品提取物对这两种自由基均具有较强的清除作用，但清除效果各不相同，其中水提取物对DPPH自由基的清除率最大达到74.5%，无水乙醇提取物对羟基自由基清除率最大达到58.6%。

关键词：山药；羟基自由基；DPPH自由基；清除率

山药，属于多年生草本薯蓣科植物，其成熟的根茎可作为药食两用类植物食用。因其营养丰富，自古以来就被视为物美价廉的补虚佳品，既可作中药治病，又可作蔬菜食用。作为中药它具有补虚抗衰、补气养血、滋阴补阳等功效。现代药理研究表明，山药中含有的糖蛋白、鞣质、山药碱以及微量元素钙、磷、铁等，具有诱生干扰素的作用，可以防止衰老[1]。陕西华县产的华州山药是陕西渭南的特色农产品，华县位于渭河的下游，其河滩沙土细疏，为山药生长提供了很好的环境，产出的根茎具有条长、皮薄、味道浓郁等特点，具有很高的药用价值。在《本草纲目》上有华州山药同怀山药同入中药，可“健脾胃，止腰痛，益肾气，治虚劳，止泄痢，化痰涎，润皮毛”[2]。目前对于华州山药提取物对自由基的清除研究鲜见报道，为此我们采用分光光度法对华州山药乙醇提取物和水提取物，以分光光度法对提取物对羟基自由基和DPPH自由基的清除效果进行了测定，其结果对华州山药资源在饮食，医疗保健等领域的进一步开发利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

华州山药：采于陕西华县，经过60℃烘干后保存。

乙醇（分析纯）；FeSO4（分析纯）；罗丹明B（分析纯）；邻苯二甲酸氢钾（分析纯）；DPPH自由基（分析纯）；盐酸（分析纯）；去离子水。

TU-1800PC型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DGB/20-002型干燥箱：重庆试验设备厂制造；BS2245型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；680型电热恒温水浴锅：北京西城区医疗器械厂；PXS-270型精密离子计：上海精密仪器公司。

1.2样品活性成分提取

将新鲜的华州山药用流动水冲洗干净，切成小片放置入干燥的烧杯中，在60℃恒温烘箱内至完全烘干。取出烘干后的样品用研砵研成粉末状干燥保存，备用。利用电子天平准确称取烘干干燥后的样品粉末2.000 0 g两份分别放入到两个干燥的圆底烧瓶内，各加入100 mL的无水乙醇和100 mL的去离子水在45℃的恒温水浴锅中分别浸泡8 h提取活性成分，用滤纸和干净的漏斗将两个提取液分别均过滤至两个250 mL的容量瓶中，在过滤后的滤渣中再加各自的提取剂，以同样方法提取，再讲二次滤液过滤至对应容量瓶内，定容至刻度待测[3]。

1.3提取物对·OH清除试验

·OH是所有活性氧自由基里毒性最大的一种自由基，它可以发生羟基化等反应，使氨基酸、蛋白质、核酸等物质氧化，是损害生物体组织细胞最大的一种活性自由基。生物体在新陈代谢过程中即可产生这种自由基，从而造成对生物体内细胞膜的过氧化，蛋白质的交联变性，核酸损伤等，给生物体带来很大的危害[4]。目前研究已经证明·OH与人体的衰老、肿瘤、辐射损伤等密切相关，因此对·OH清除的研究尤为重要。适当给生物体补充外源性的抗氧化剂，即可清除体内产生的·OH，从而改善这些状况。我们以分光光度法测定了华州山药样品乙醇提取物和水提取物对·OH的清除作用，清除效果以清除率表示。

1.3.1测定方法

以Fenton反应产生·OH，并立即与罗丹明B发生氧化发应，使其退色，吸光度降低为A0，当加入样品提取物后，提取物中的活性成分可以清除反应产生的·OH，从而使体系吸光度下降的程度降低为可以使体系吸光度下降的程度降低为AS，若罗丹明B的吸光度为A，则清除率D按下面公式计算。

条件的控制会对对·OH的生成以及样品提取物对其清除作用有较大影响，为此我们通过单因素试验确定最佳试验条件。具体如下：

1.3.1.1pH的控制

分别配置pH 2.0～6.0的邻苯二甲酸氢钾-HCl缓冲溶液，加入到罗丹明B-FeSO4-H2O2体系中测定体系ΔA的变化，结果表明，采用pH 2.5的缓冲溶液，体系的ΔA值最大，因此选择最佳pH条件为pH=2.5。

1.3.1.2Fe2+加入量的控制

当其它条件不变时，分别加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL的Fe2+标准溶液（5×10-3mol/L）对体系ΔA值测定，结果表明，开始Fe2+标液体积越大ΔA值也逐渐增大，但达到2.50 mL后时，ΔA值不在变化，因此最佳的Fe2+用量控制在2.50 mL最好。

1.3.1.3H2O2加入量的控制

分别加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL H2O2（2×10-4mol/L）测定ΔA值，试验结果表明，随着H2O2用量的增加ΔA值增大，当加入体积达到2.00 mL时，ΔA值稳定，所以本试验采用2×10-4mol/L H2O2溶液用量为2.00 mL。

1.3.1.4显色剂加入量的控制

分别加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL罗丹明B标准溶液（2×10-4mol/L），测定空白参比体系和羟基自由基生成体系吸光度，结果表明，罗丹明B体积越大，体系ΔA越大，但体积超过2.00 mL时，由于空白参比液的吸光度太大，大大超出测定仪器读数范围，因此体积用量不宜超过2.00 mL。

1.3.1.5试剂加入顺序

试验以罗丹明B的显色作用来测定·OH，因此必须保证体系所产生的羟自由基能与罗丹明B充分反应，再加入试剂时应该先加入罗丹明B和缓冲溶液，再加入Fe2+和样品提取物，最后再加入H2O2。

1.3.1.6反应时间控制

在上面的条件下对体系测定吸光度，每隔1 min读数，结果表明，在1 min～5 min内，吸光度数值迅速下降，在5 min～10 min内，数值无变化，说明反应完全，因此最佳的反应时间控制在7 min后读数。

1.3.2·OH清除率测定

在以上最佳条件下我们测定了样品提取物对·OH的清除率，具体做法是：给3支50 mL容量瓶中都先加入罗丹明B标液各2.00 mL和缓冲溶液（pH 2.5）5.00 mL，然后向其中两支容量瓶中加入Fe2+标液2.50 mL和H2O2标液2.00 mL，另一支不加，定容摇匀，放置7 min后在554 nm下测定其吸光度，分别记录读数A和A0。把样品提取物加入到·OH生成体系中，在相同条件检测，记录吸光度为AS，按1.3.1计算清除率。

1.4提取物对DPPH自由基清除试验

DPPH自由基是一种氮中心自由基，由于自身结构中有3个苯环，空间位阻作用使其表现的非常稳定。由于该自由基存在单电子，在515 nm处有较强吸收，当样品提取物中含有自由基清除剂存在时，该自由基的单电子被配对，颜色就变浅，吸光度变小。研究发现这种退色程度与其接受电子之间存在明显的量效关系[4]。因此，可直接在517 nm波长处测定吸光度的变化来评价所加入提取物对该自由基的清除情况。具体做法是：

准确称取0.008 0 g的DPPH自由基于50 mL容量瓶中，以95%乙醇溶解得到DPPH自由基标准溶液（4×10-4mol/L）备用。分别移取样品提取物溶液1.00 mL 于50 mL容量瓶，以95%乙醇定容至刻度，作为测定参比溶液使用。移取配置好的DPPH自由基标液3.00 mL，于50mL容量瓶中以95%乙醇定容，在517nm下测定，记录吸光度为Ac；另取样品提取物1.00 mL于50 mL容量瓶，加入DPPH自由基标液3.00 mL，测定吸光度并记录为Ai，则清除率D按下式计算：

2　测定结果

按照上述1.3和1.4中的方法，测定了两种样品提取物对羟基自由基和DPPH自由基自由基的清除率，结果如表1所示。

表1　样品提取物对自由基清除率测定Table 1　Determination of free radical scavenging rate of sample extracts

由表1中的数据可以看出，样品的提取物对羟基自由基和DPPH自由基都有一定的清除能力，但清除率不尽相同。其中样品无水乙醇提取物对羟基自由基有较强清除作用，清除率达到58.6%，水提取物对DPPH自由基有很强清除作用，清除率为74.5%。

3　结论

以无水乙醇和水为提取试剂，提取了陕西华州山药的活性成分，并测定了提取物对羟基自由基和DPPH自由基的清除率。结果表明，样品提取物对两个自由基均具一定的清除作用，但不同提取剂提取物对两个自由基的清除效果不同。DPPH自由基的清除试验说明，水提取物清除效果好，应当为首选；羟基自由基的清除试验说明，无水乙醇提取物清除效果较好。本研究仅对两种提取物在体外的抗自由基能力进行了测定，其在体内的自由基清除作用以及样品提取物中各种活性成分对自由基清除率的贡献值得进一步研究。

参考文献：

[1]尚晓娅.山药多糖的制备及其体外抗氧化活性[J].化学研究,2010, 21(2):72-75

[2]刘健.华州山药无公害栽培技术[J].西北园艺,2013(5):15-16

[3]王征帆.四种护脾养胃类中药水提物抗氧化能力测定[J].天然产物研究与开发,2013,25(9):1271-1273

[4]郑荣梁,黄中洋.自由基生物学[M].北京:高等教育出版社,2007

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.002

收稿日期：2014-05-02

基金项目：陕西省自然科学基础研究计划项目（2014JQ2074）；渭南师范学院科研项目（15YKP007）；渭南师范学院教改项目（JG201529）；渭南师范学院特色学科项目（14TSXK04）；渭南师范学院大学生创新项目（15TXK032）

作者简介：王征帆（1981—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：食品及环境分析。

Research on Radical Scavenging in Huazhou Yam Extracts

WANG Zheng-fan1，YANG Yan-li2，SUN Xiao-xia1，LIU Xia1，QI Chun-mei1，LI Sha1
（1.School of Chemistry and Life Science，Weinan Normal University，Weinan 714000，Shaanxi，China；2.Department of Heat Energy and Chemical Engineering，Shaanxi Institute of Technology，Xi'an 710302，Shaanxi，China）

Abstract：The active ingredients of yam from Huazhou Shaanxi were extracted with hydroxyl radicals and water respectively for further development and utilization of it，after the comparison of their extract scavenging ability of hydroxyl radicals and DPPH free radicals.Results showed that yam samples have strong scavenging effect，but with different effect.Water extract on the DPPH free radicals clearance rate reached 74.5%，maximum alcohol extract on hydroxyl radicals clearance up to 58.6%.

Key words：Huazhou yam；hydroxyl radicals；DPPH free radicals；clearance rate