张立娟，王麒琳，温禄云，王玥玮，张斌，任亚妮（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

酶解条件对猪骨浆水解物还原能力及水解度的影响

张立娟，王麒琳，温禄云，王玥玮，张斌，任亚妮
（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

摘要：研究不同的酶解条件对猪骨浆水解物抗氧化能力和水解度的影响。将猪骨用碎骨机和骨泥机制成骨浆，用碱性蛋白酶水解，测定不同底物浓度、酶添加量、pH、温度等条件下猪骨浆水解物的亚铁还原能力和水解度。经过单因素试验最终确定碱性蛋白酶水解猪骨浆的最佳酶解条件为：底物浓度30%、加酶量1.5%、温度55℃、pH9.0、水解时间3 h。在此条件下得到的猪骨浆水解物的FRAP值为625 μmol/L，水解度为8.6%。

关键词：酶解条件；猪骨浆水解物；亚铁还原能力；水解度

猪骨是屠宰加工业中一种非常重要的副产物，约占胴体重的10%～15%[1]。猪骨中含有多种人体需要的营养物，含有较高的蛋白质和磷脂质、磷蛋白和各种氨基酸，还含有多种矿物质，如钙、磷、铁及B族维生素等，而且钙和磷的比值近似2∶1，是人体吸收钙磷的最佳比例[2]，特别有利于人体吸收。猪骨含有构成蛋白质的所有氨基酸，且氨基酸比例均衡，属于优质蛋白[3]。猪骨蛋白的主要成分为胶原蛋白[4]，胶原蛋白是大分子蛋白质，并不能被人体直接吸收。胶原蛋白通过酶解生成游离氨基酸、小肽等，利于肠道吸收，胶原蛋白水解液具有加强皮下细胞代谢、防止老化、美容等生理效果[5]，具有抗衰老、抗氧化、抗高血压、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病的生理功能[6]。因此猪骨资源是一个有待开发的丰富的营养宝库。

本研究以猪骨为研究对象，采用酶法对其进行水解，以获取较强抗氧化肽段为研究目标，考察不同的酶解条件对亚铁还原能力和水解度两个指标的影响，以期为酶法生产猪骨蛋白抗氧化肽提供新的技术参考。

1　材料与方法

1.1材料与主要试剂

猪骨：由天津市肉类联合加工厂提供；碱性蛋白酶（酶活力为8 000 U/g）：诺维信公司（中国）；三吡啶三吖嗪[2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：Sigma公司；FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、氢氧化钠、醋酸等试剂为分析纯。

1.2设备与主要仪器

PG-300碎骨机、GN-80骨泥机：廊坊利杰食品机械有限公司；UV-5800PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：金坛市精达仪器制造有限公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁仪器厂；天平等。

1.3方法

1.3.1猪骨浆的制备

剔除新鲜猪腿骨上的肉、皮、骨膜等非骨物质，放入温度低于-18℃的冰柜中进行冷冻。冷冻时间24 h以上至猪骨完全冻透。将冻透的大骨放入碎骨机中进行粉碎，粉碎成骨碎片。将骨碎片用自来水反复洗涤以除去骨髓及杂质，重复几次，而后将处理后的骨碎片骨与水按1∶1（质量比）投入到骨泥机中进行粗磨，收集粗磨后的骨泥再次投入到骨泥机中进行精磨，将猪骨磨成细度100目以上的骨浆，备用。

1.3.2猪骨浆成分分析

水分含量测定方法：GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》；蛋白质含量测定方法：GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；灰分含量测定方法：GB 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；脂肪含量测定方法：GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》。

1.3.3猪骨浆的酶解

将猪骨浆置于酶解反应罐中，考察底物浓度、酶添加量、pH、温度及反应时间5个因素对亚铁还原能力和水解度的影响。酶解过程中以0.5 mol/L NaOH溶液调节至酶解最佳pH，记录NaOH溶液的用量。前期试验确定酶解猪骨浆的最佳酶种类为碱性蛋白酶。

1.3.4水解度的测定

蛋白质的水解度是指蛋白质在水解过程中被裂解的肽键占蛋白质总肽键的百分数[7]。

水解度的测定采用pH-Stat法[5]。水解度的计算按下式计算：

式中：h为单位质量蛋白质中被水解的肽键的量，mmol/g；htot为单位质量蛋白质中肽键的总量，mmol/g，骨蛋白htot=11.1 mmol/g；B为水解过程中所消耗的碱液体积，mL；Nb为碱液的摩尔浓度，mol/L；1/α为校正系数（碱性蛋白酶的1/α为1.01）；MP为水解液中蛋白质的总量，g。

1.3.5还原能力的测定

1.3.5.1FeSO4标准曲线的绘制[8]

FRAP（ferric reducing antioxidant power）工作液的配制：取25 mL 0.3 mol/L的醋酸盐缓冲液（pH3.6），2.5mL10mmol/L的TPTZ溶液，2.5mL20mmol/L的FeCl3· 6H2O溶液，临用前混合。

FeSO4标准曲线的制作：精密移取不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）的FeSO4标准液0.3 mL，准确加入2.7 mL预热至37℃的FRAP工作液，摇匀后放置10 min，于593 nm处测吸光值。以吸光度为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.5.2猪骨浆水解物亚铁还原能力的测定[9]

准确吸取猪骨浆水解物样品溶液0.3 mL，加入2.7mL预热至37℃的TPTZ工作液。摇匀后放置10min，于593 nm波长处测其吸光值（用双蒸水作为参比）。以双蒸水代替样品加入FRAP工作液作为空白。由反应后吸光值在标准曲线上获得的相应的FeSO4浓度（μmol/L）定义为FRAP值。FRAP值越大，还原能力越强。

2　结果与分析

2.1猪骨浆的成分分析

猪骨浆的成分分析见表1。

表1　猪骨浆成分Table 1　Ingredient of swine bone seriflux

2.2FeSO4标准曲线的绘制

FeSO4溶液的标准曲线如图1所示。

图1　FeSO4浓度与吸光值的关系曲线Fig.1　Relation curve of FeSO4concentrations and absorbance

由图1可知，FeSO4浓度在100μmol/L～1000μmol/L之间时，吸光值与FeSO4溶液浓度呈线性关系，回归方程为y=0.000 5x-0.016 8，R2=0.999 4。

2.3底物浓度对猪骨浆水解物亚铁还原能力和水解度的影响

在加酶量1.5%，pH9.0，温度55℃的条件下，酶解猪骨浆3 h。考察底物浓度（20%、25%、30%、35%）对亚铁还原能力和水解度的影响，结果如图2所示。

由图2可知，FRAP值随着底物浓度的增加呈先增加后减小的趋势，底物浓度达30%时最大；水解度随底物浓度的增加而增大，在底物浓度为30%～35%时较大，但由于底物浓度升高，加热使其黏度上升，搅拌困难，且本试验主要考察水解物的抗氧化能力，因此确定底物浓度为30%。

图2　底物浓度对FRAP值和水解度的影响Fig.2　The effect of substrate concentration on FRAP and degree of hydrolysis

2.4加酶量对猪骨浆水解物亚铁还原能力和水解度的影响

在底物浓度30%，pH9.0，温度55℃的条件下，酶解猪骨浆3 h。考察加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对亚铁还原能力和水解度的影响，结果如图3所示。

图3　不同加酶量对FRAP值和水解度的影响Fig.3　The effect of enzyme dosage on FRAP and degree of hydrolysis

由图3可知，1.5%的加酶量可以得到较好的FRAP值及水解度。加酶量在0.5%～1.5%时，FRAP值及水解度随着加酶量的增加而增大。加酶量超过1.5%时水解度上升缓慢，且FRAP值有所下降。酶用量过多会增加成本，且过多的用酶量会使水解物的抗氧化能力下降，因此本试验确定加酶量为1.5%。

2.5pH对猪骨浆水解物亚铁还原能力和水解度的影响

在底物浓度30%，加酶量1.5%，温度55℃的条件下，酶解猪骨浆3 h。考察pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10）对亚铁还原能力和水解度的影响，结果如图4所示。

由图4可知，pH在8.0到9.0时，FRAP值及水解度随着pH的增加而增大，pH在9.0到9.5时可以得到较好的FRAP值和水解度，低于9.0高于9.5的pH都不利于酶解进行，这可能与pH对蛋白结构及带电荷情况的影响有关[7]。当pH增至10时FRAP值和水解度明显降低。从图4中可以看出，pH9.0时水解度最大，此时FRAP值也最高，因此，选择pH9.0。

图4　pH对FRAP值和水解度的影响Fig.4　The effect of pH on FRAP and degree of hydrolysis

2.6温度对猪骨浆水解物亚铁还原能力和水解度的影响

在底物浓度30%，加酶量1.5%，pH 9.0的条件下，酶解猪骨浆3 h。考察温度（45、50、55、60、65℃）对亚铁还原能力和水解度的影响，结果如图5所示。

图5　温度对FRAP值和水解度的影响Fig.5　The effect of temperature on FRAP and degree of hydrolysis

由图5可知，温度为55℃时，FRAP值与水解度均达到最大。故选用55℃为酶解温度。酶大多数由蛋白质组成，只有在合适的温度下才能保持其最佳的活性构象，温度过高时，因酶分子吸收过多能量，使其空间结构被改变，导致变性，进而活性降低甚至丧失催化功能[6]。

2.7时间对猪骨浆水解物亚铁还原能力和水解度的影响

在底物浓度30%，加酶量1.5%，pH9.0，温度55℃的条件下，酶解猪骨浆。考察反应时间（1、2、3、4、5 h）对亚铁还原能力和水解度的影响，结果如图6所示。

图6　时间对FRAP值和水解度的影响Fig.6　The effect of time on FRAP and degree of hydrolysis

由图6可知，水解度随着反应时间的延长而增大，FRAP值在3h处达到最大。水解过程中蛋白质随着反应时间的延长被逐步水解为小肽及氨基酸，而具有强抗氧化能力（由FRAP值体现）的肽段一般是由特定氨基酸残基组成的，随着反应的进行，从猪骨浆蛋白上水解下来的具有强抗氧化能力的肽段将被进一步水解，进而丧失抗氧化活性[6]，导致整体的FRAP值降低。由于本试验的目的是得到具有较强抗氧化能力的肽段，因此，确定酶解时间为3 h。

3　结论

经试验最终确定碱性蛋白酶（酶活力为8 000 U/g）酶解猪骨浆的最佳酶解条件为：底物浓度30%、加酶量1.5%、温度55℃、pH 9.0、水解时间3 h。在此条件下得到的猪骨浆水解物的FRAP值为625 μmol/L，水解度为8.6%。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.007

收稿日期：2015-01-07

基金项目：天津市科研院所技术开发工作扶持经费项目（YSK2012-23）

作者简介：张立娟（1983—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：肉制品加工。

The Effect of Enzymolysis Condition on Reducing Power and Hydrolyzed Degree of Swine Bone Seriflux

ZHANG Li-juan，WANG Qi-lin，WEN Lu-yun，WANG Yue-wei，ZHANG Bin，REN Ya-ni
（Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Abstract：Antioxidant activity and degree of hydrolysis of swine bone seriflux hydrolysate at different enzymolysis condition were studied.Swine bone seriflux hydrolysate which was processed by bone cutter and bone paste machine was hydrolyzed by alcalase.The FRAP and degree of hydrolysis（DH）were determined at different substrate concentration，enzyme dosage，pH，temperature and hydrolysis time.By using single factordesign，the optimal enzymatic hydrolysis conditions by alcalase were as follows：substrate concentration 30%，enzyme dosage 1.5%，pH 9.0，temperature 55℃，hydrolysis time 3 h.The FRAP and DH of swine bone seriflux on this condition were 625 μmol/L and 8.6%respectively.

Key words：enzymolysis condition；swine bone seriflux hydrolysate；FRAP；degree of hydrolysis