宋美丹 都格尔 麻春杰

(1.锡盟蒙医医院，内蒙古 锡林郭勒 026000;2.内蒙古国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特010065;

3.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特010110)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)易损斑块(Vulnerable Plaque，VP)是指不稳定和有血栓形成倾向的斑块，具有破裂倾向、易于发生血栓形成和(或)进展迅速的危险斑块［1］。大量研究表明，约70% 至80% 的AS 血栓形成(Atherothrombosis)是由于轻、中度狭窄的动脉斑块的破裂、继发血栓形成所致，动脉粥样硬化血栓形成疾病以高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、并发症多等成为全球性的重负和世纪的挑战。根据有关报告，由动脉粥样硬化血栓形成导致的死亡占人群总死亡的28.7% ～52%［2］，因此，稳定易损斑块是防治动脉粥样硬化血栓形成性疾病的关键，亦是目前医学界防治心脑血管急性事件发生的重要目标。国内外学者认为VP 的不稳定主要因素很多：如与脂质代谢异常等方面的因素有关。斑块的破裂与其所含的胆固醇量有关，当粥样物质在动脉斑块中所占比例超过40%时，斑块极易破裂，因此，血脂异常与斑块的易损性密切相关，而调脂治疗能够减少斑块内脂质含量和张力、减轻炎症、改善血栓形成和纤溶活性之间的平衡。临床采用的介入治疗只能缓解局部病变而不能抑制全身AS 的炎症反应。因此，降脂药物是稳定易损斑块治疗不可或缺的武器。

目前应用药物对易损斑块防治的措施，现今专家在此方面已达成共识，已采用他汀类药物等药物，可从不同角度对斑块的稳定性进行干预，逆转易损斑块或抑制斑块破裂。但各种药物的毒副作用，如他汀类药物肝功能损伤、阿司匹林引起出血等，至此很多患者无法接受治疗。因此，在心脑血管急性事件高发、难控制的当今，尽快寻找、开发高效、副作用少、能够稳定斑块的理想药物迫在眉睫。传统蒙药额尔敦-乌日勒(珍宝丸)以其确切的疗效和安全、低毒等优势和鲜明的蒙医药特色、独特的主治功效，在临床中起到重要作用。在防治心脑血管疾病方面有潜在价值，已引起学者们的关注。近些年对额尔敦-乌日勒的研究逐步深入，临床研究表明其治疗心脑血管疾病疗效显著［3-5］。前期研究表明，额尔敦-乌日勒具有显著的调节血脂，改善血液流变学可能是其抗AS 作用机制之一，还能够有效干预脉粥样硬化的形成和发展［6］，具有消退早期动脉粥样硬化的作用，可能通过降脂、抗炎等途径发挥作用［7］。在实验研究中发现，额尔敦-乌日勒与阳性对照药阿司匹林［8］和辛伐他汀［6］有相似的作用，甚至有的作用优于辛伐他汀。而且这2 种西药是在临床中，稳定VP 的主要药物［9］。因此，我们推测额尔敦-乌日勒在斑块稳定方面是最具优势，为传统蒙药稳定易损斑块的研究及应用提供科学依据。额尔敦-乌日勒有效系统中各化学成分具有不可缺少性和不可分离性地保证其原来的功用和主治。额尔敦-乌日勒复方化学成分复杂，成分之间或起协同作用，或起相反(相g、相畏)甚至拮抗作用。通过现代科学技术，阐明复方在体内的吸收、分布、转运(代谢)和排泄过程的化学成分，其难度很大［10］。目前在治疗AS-VP 引起的脑血管病领域，我国二次研发成功的现代中(蒙)药仅有一种天欣泰血栓心脉宁片(吉林华康药业生产的)。许多蒙药的古方、验方目前仍被国内外医学家广为推崇［11］。这些都是新药开发的源泉。通过对这些方剂进行拆方研究，可以将部分药味省去，使组方更严谨、简练、科学，又可快速起效，更适合临床应用，充分体现拆方研究的优越性［12］。因此，为大复方额尔敦-乌日勒的二次研发开辟一条新路，创立其优化方进行研究。

1 材料

1.1 药物与试剂：额尔敦-乌日勒［13］：内蒙古蒙药股份有限公司;国家准字：Z15020410;【规格】2g/10 粒，30 粒/瓶;【生产日期】2012-07-12;【产品批号】120706;【有效期】至2015-06。额尔敦-乌日勒优化方：与额尔敦-乌日勒同样标准。辛伐他汀片：山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司;国家准字：H20083840;生产日期：20121007;规格：20mg/片，12 片板/1，板/盒;有效期：20141006。青霉素钠注射液：华北制药股份有限公司;国家准字：H13020655;生产日期：20120716;规格：160 万单位/瓶×50 瓶/盒;有效期：201406。肝素钠注射液，天津生物化学制药有限责任公司;执行标准：国家准字：H12020505 生产日期：20121007;规格：1.25 万单位/2mL，2mL /支，2mL×10 支/盒;有效期：20141006。3%戊巴比妥纳注射液，胎牛血清白蛋白(Albumin Bovine fraction V)：上海生物工程有限公司，鸡蛋黄、猪油、胆固醇：北京爱普华美生物科技有限公司生产，批号：20120715;血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)测试盒均购自南京建成生物技术有限公司。

1.2 动物：健康新西兰白兔，雄性，体重(2.0 ±0.2)kg，90只。由北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂提供(许可证编号：SCXK(京)2012-0005，防疫合格证号20120038)，试验在内蒙古医科大学蒙药研究院动物实验中心完成。实验条件：(18 ±2)℃，相对湿度(40 ± 15)%。

1.3 主要仪器：日立7180 型全自动生化分析仪：制造商—日本株式会社日立高新技术(日本国东京港区西新桥—丁目24 盘14 号);球囊扩张导管(人用)：导引导管规格：145cm×0.84mm，导引导丝规格：145 ×0.36mm，球囊规格：20 ×2.5，テルモ株式会社(日本)，REF/コ—ド番号：DCRH2520EHW，LOT/制造番号：120209，有效期：2015-01］;压力泵：规格：20mL 美国麦瑞，PL303 电子天平，TDL-5-A 离心机：上海安亭科学仪器制造厂。

2 方 法

2.1 家兔分组喂养：取90 只家兔，所有均单笼喂养，普通饲料适应性喂养1wk 后，按抽签法随机分为正常对照组(10 只)与造模组(80 只)。正常对照组喂普通饲料，每只予150g. d-1，造模组喂高脂饲料(1.0%胆固醇、5.0%猪油、5.0%蛋黄粉、89%基础饲料)，每只予150g(普通饲料50g、高脂饲料100g). d-1，自由摄食，正常对照组与造模组分别灌胃蒸馏水，饮水不限，取材截止。

2.2 制定优化方：额尔敦-乌日勒方优化方是掌握优化方研究与开发的发展方向及目标［14］、研究思路［15］、方剂拆方研究方法［16］基础上，遵照蒙药“主辅佐使”配药理论和蒙药性能、药味、功效主治、功用发挥、不良反应等文献理论为基础，结合现代药理学的化学成分、药理作用、药毒副作用以及临床应用等科学理论依据，以否定之否定规律，从额尔敦-乌日勒方剂中选出功效、治疗、有效成分和药理作用以及功用发挥、临床应用等共同交叉点的单药来重新组合成的新方剂。优化方中以具镇静及白脉病之良药珍珠(制)25g 为主;红花3.5g 以脏腑病及调理体素为辅;栀子5g 以清血热及陈热扩散所致的通风、痹病，荜茇3.5g 以护养胃火，白云香(枫香脂)4g 以清心肺骚热等，为之佐使，各药合用7 味药组成。成分及其剂量以额尔敦-乌日勒(内蒙古蒙药股份有限公司。卫生部药品标准：蒙药分册ZZ-8358;蒙药准字：Z15020410)为标准［13］。

2.3 造模分组给药：造模组则采用下述方法建模。病变接近于人体不稳定斑块病变的发生发展过程的相对操作简单、造模成功率高、成本低、重复性好的建模方法［17］，将造模组选取采用复合因素(采用高脂饮食加免疫损伤和球囊拉伤方法)建模［18］，成功建立符合VP 病理形态学特征的动物模型。从实验第1wk 开始按造模组家兔喂养法给予高脂饲料，取材截止。第2wk 时(高脂饲料一wk后)予造模组家兔经耳缘静脉一次性注射牛血清白蛋白250 mg/mL/kg。第4wk 行经股动脉球囊拉伤术，术前12 h 禁食不禁水，以3%戊巴比妥钠30 mg/kg 经耳缘静脉麻醉后将动物固定于手术台。左侧腹股沟wk 边区域剪毛常规皮肤消毒，沿股动脉走行切开皮肤，分离皮肤和皮下组织，分离股动脉约2 cm。结扎动脉远端，用手术丝线提起动脉近心端阻断近端血流。在动脉壁上约呈450“v”形剪开一小口，逆行插入肝素生理盐水(1：15 稀释)冲洗过的球囊导管(内置钢丝引导)至胸主动脉处。送入约20cm，抽出导丝，连接于50 mL 注射器，注入约20 ～30 mL 空气，使球囊内压力达到约2 个大气压。维持此状态缓慢拉出导管至其10cm 刻度处，然后回抽注射器解除球囊内压力，即有较强的阻力感继而突然的落空感即可。重新插入导管，再牵拉1 次，以确保内膜拉伤，反复2 次后撤出导管，结扎近心端。逐层缝合皮下组织和皮肤，青霉素钠注射液冲洗创面。约8wk(确定模型成功后)将造模组随机分为模型组(20 只)，额尔敦-乌日勒组(20 只)和额尔敦- 乌日勒优化方组(以下称为：优化方组)(13只)，辛伐他汀组(15 只)。分别给予相应药物干预，给予额尔敦-乌日勒及其优化方组家兔各0.4g/kg/d;给予辛伐他汀组家兔各5mg/kg/d。继续予以高脂饮食，24wk 取材截止。

2.4 收集标本 取材前12h 禁食，用3%的戊巴比妥钠30 mg/kg 经兔耳缘静脉麻醉后，固定于手术台上，用50 mL 注射器体外心脏采血，3000 r/min 离心10 min 后提取血清，血清贮存于-80°C 冰箱中备用;备用;经耳缘静脉空气栓塞处死家兔，取其主动脉、心脏、肝脏和肾脏等器官脏器，常规处理，为它项检测备用。

2.5 统计学方法：应用SPSS 13.0 统计软件进行数据统计学处理。采用ANOVA 方差分析并行方差齐性检验，两组均数间比较采用t 检验，结果以均数加减标准差(±s)表示，以P＜0.05 为有显著性差异。

3 结 果

3.1 一般状况：每天喂养、灌药观察当中，家兔除了用于预实验和死亡以外，其余正常对照组家兔：精神状态良好，行为活动、反应灵敏，毛色较白有光泽，目睛光亮有神，饲喂时不断抓挠食盒，摄食、饮水、粪便未见明显异常。模型组家兔：从5wk 左右开始发现精神欠佳，目光呆滞，活动少，饮食可;8wk 左右饲喂时较少有反应，喜卧少动，饮食有所减少，毛色变暗;10wk 左右发现目睛混浊，可见有脂肪沉积，饮食略有增加;至12wk 时精神差，对外界刺激反应迟钝、多寐、饮食尚可、余同前。30d 称体重1 次，模型组与正常对照组体重随时间变化呈增长趋势，但同一时间点两组间体重比较差别不大，无统计学意义(P＞0.05)。可以证实此造模因素基本未影响模型兔的正常生长，见表1。

表1 正常组与模型组家兔体重比较(±s，㎏)

3.2 家兔生存及死亡情况：试验用90 只家兔，总存活率80%，总死亡率20%;实验造模总存活率为82.74% 。分析死亡原因：用于造模(球囊拉伤手术)预实验时3 只;用于取材(处死)预实验时2 只;球囊拉伤手术时死亡3 只，其中2 只因麻醉过深致死;1 只因球囊破裂栓塞而死;复合造模过程中死亡4 只，原因不明;正常组(10 只)死亡1 只，死亡率10%;喷嚏、鼻腔分泌物增多、呼吸困难、急促而致死亡;模型组(20 只)死亡2 只，死亡率10%;1 只术后5d呼吸困难、急促死亡，1 只厌食、消瘦数日而死;额尔敦-乌日勒组(20 只)死亡1 只，死亡率5%;因腹泻、腹部膨胀、厌食、体重下降而死亡;额尔敦-乌日勒优化方组(13 只)死亡1 只，死亡率7.69%，术后15d 感染死亡，其他家兔手术创口愈合良好。辛伐他汀组(15 只)死亡6 只，死亡率40%，多为厌食、逐渐消瘦致体质较差而死，尸检发现脂肪肝或肝组织糜烂，肾积水或萎缩的病变。

3. 3 血清学检测：将兔血静置1h 后3000r/min 离心10min，提取血清，采用全自动生化仪检测各组家兔血清TC、TG、LDL-C 和HDL-C(酶法检测)等血脂指标变化和ALT、AST、-GGT(速率法检测)与CRE、BUN(酶促法检测)等肝肾功能指标的变化。正常组的血脂水平在整个实验过程中无明显变化，实验进行至第24wk，模型组TC、HDL- C、LDL- C 均较正常组明显升高(P＜0.05)，优化方组TC、TG、HDL- C 均低于模型组(P＜0.05)，LDL- C 则无明显差异，见表2。

表2 各组对家兔血脂(TC，TG，HDL-C，LDL-C)代谢的影响比较(mmol /L，±s)

模型组AST、-GT 均较正常组明显升高(P＜0.05)，辛伐他汀组ALT 、AST、-GT 均较正常组明显升高(P＜0.05)，额尔敦-乌日勒组ALT 、-GT 均低于模型组(P＜0.05);优化方组ALT、AST 均低于模型组(P＜0.05)，见表3。

表3 各组对家兔肾功能(CRE，BUN)影响的比较(±s)

模型组CRE 、BUN 均较正常组明显升高(P＜0.05)辛伐他汀组CRE 较正常组明显升高(P＜0.05)，额尔敦-乌日勒组CRE 较正常组明显升高(P＜0.05);优化方组CRE 、BUN 均较正常组明显升高(P＜0.05)，见表4。

表4 各组对家兔肝功能(6-GT，ALT，AST)影响的比较(u/L，±s)

4 讨 论

本实验所建立的AS-VP 模型其成功机制可能为：高胆固醇血症与急性免疫损伤协同促进AS 早期病变的形成，其后行球囊拉伤术损伤血管内皮，致使斑块区炎症反应大量激活，促使斑块向不稳定的方向发展。(6)Shah［19］(6)认为，血清脂蛋白水平，特别是LDL-C/ HDL-C 、TC/HDL-C 与AS 及相关疾病如心肌梗死密切相关，是斑块易损的独立危险因素。即内皮细胞损伤引起血管炎症，继而发生泡沫细胞形成和纤维增殖反应;在病理学上表现为脂纹、粥样斑块和纤维斑块形成［20，21］。脂代谢异常血清中TG、TC 和LDL 的升高是诱发动脉粥样硬化的首要因素之一［22］。它与血管内皮的损伤都是粥样硬化形成的始动环节［23］，脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化最主要的病理生理基础，血液中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的增多和高密度脂蛋白的减少，促使胆固醇在动脉管壁的沉积，形成动脉硬化，并造成血液流变学的异常［24］。因此如何有效地控制血脂、降低血液比黏度，是治疗缺血性心脑血管疾病的关键［25，26］。遗传、流行病和临床等方面的研究已证实血清胆固醇的升高与冠心病发病率呈正相关，降低血清胆固醇浓度，改善血流变，就能预防冠心病及其他心脑血管疾病的发生和发展［27，28］。辛伐他汀可用于降低升高的总当固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B 和甘油三酯。且辛伐他汀升高高密度脂蛋白胆固醇，从而降低低密度脂蛋白/高密度脂蛋白和总胆固醇/高密度脂蛋白的比率，由此对动脉粥样硬化和冠心病的防治作用。

在成功造模基础上，以辛伐他汀作对照，观察额尔敦-乌日勒及其优化方预防性给药对实验性家兔AS-PV 形成的干预作用。结果表明，分别给予相应药物干预，对高血脂所致AS-PV 有明显的拮抗作用，辛伐他汀虽有一定的作用，但额尔敦-乌日勒及其优化方的作用不低于辛伐他汀。而且辛伐他汀损害肝肾功能，尤其是辛伐他汀组ALT 、AST、-GT 均较正常组明显升高(P＜0.05)，辛伐他汀组(15 只)死亡6 只，死亡率40%，比任何组和总死亡率高几倍。额尔敦-乌日勒及其优化方没有影响肝功任何指标。据此推测，额尔敦-乌日勒及其优化防治AS 的机制可能与其降低血脂和抗脂质过氧化作用有关。通过降低血脂水平，减少脂质在细胞的沉积。同时，其抗脂质过氧化作用可减轻动脉内皮细胞损害，抑制血管平滑肌的增生，从而阻止了AS 的形成。研究表明，额尔敦-乌日勒优化方确切具有安全、低毒等优势和鲜明的蒙药特色、独特功效，其作用不低于额尔敦-乌日勒和辛伐他汀，并且额尔敦-乌日勒优化方调节HDL-C 、TG 、TC 指标作用优越于额尔敦-乌日勒和辛伐他汀。可能通过调节血脂，进而改善血液流变指标，即降低红细胞聚集指数、升高红细胞变性指数、降低全血黏度，而起到对高血脂所致AS-PV 有明显的拮抗作用机制。除了以上作用机制以外研究优化方的特色与创新之处是：首次采用现代科技手段，通过动物实验以西药辛伐他汀做对照、进行原方额尔敦-乌日勒比较，发掘蒙、西药各自的作用特点，证实额尔敦-乌日勒优化方干预AS 的作用优势，提供临床研究和应用实验依据，为防治AS 创新药的研发和额尔敦-乌日勒二次开发奠定基础。

综上，优化方研究是为进一步研发额尔敦-乌日勒及其优化方奠定基础的新起点内容，有助于推进蒙医药现代化的进程。采用现代科技手段，证实传统蒙药额尔敦-乌日勒及其优化方干预AS-VP 稳定性作用机制，从而为临床防治AS 血栓形成疾病提供实验依据，不仅丰富民族医药防治心脑血管疾病的基础研究，而且增添蒙药药理学新内容。

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