都格尔 麻春杰 乌兰其其格 莲 花

(1.内蒙古国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065; 2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)易损斑块(Vulnerable Plaque，VP)是指不稳定和有血栓形成倾向的斑块，具有破裂倾向、易于发生血栓形成和(或)进展迅速的危险斑块［1］。大量研究表明，约70% 至80% 的AS 血栓形成(Atherothrombosis)是由于轻、中度狭窄的动脉斑块的破裂、继发血栓形成所致，动脉粥样硬化血栓形成疾病以高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、并发症多等成为全球性的重负和世纪的挑战。根据有关报告，由动脉粥样硬化血栓形成导致的死亡占人群总死亡的28.7% ～52%［2］，因此，稳定易损斑块是防治动脉粥样硬化血栓形成性疾病的关键，亦是目前医学界防治心脑血管急性事件发生的重要目标。大量研究证明，血清基质金属蛋白酶(matri metalloproteinase，MMPs)是造成斑块不稳定的重要原因之一。MMPs 是一组可消化细胞外基质(ECM)的重要酶类，它通过降解纤维帽成分，破坏其结构加速斑块破裂导致ACS 发生［3］。蒙药额尔敦-乌日勒(珍宝丸)以其确切的疗效和安全、低毒等优势和鲜明的蒙医药特色、独特的主治功效，在临床中起到重要作用。在防治心脑血管疾病方面有潜在价值，已引起学者们的关注。近些年对额尔敦-乌日勒的研究逐步深入，临床研究表明其治疗心脑血管疾病疗效显著［4，5］。前期研究表明，额尔敦-乌日勒具有显著的调节血脂，改善血液流变学可能是其抗AS 作用机制之一，还能够有效干预动脉粥样硬化的形成和发展［6］，具有消退早期动脉粥样硬化的作用，可能通过降脂、抗炎等途径发挥作用［7］。在实验研究中发现，额尔敦-乌日勒与阳性对照药阿司匹林［8］和辛伐他汀［6］有相似的作用，甚至有的作用优于辛伐他汀。因此我们，通过观察额尔敦-乌日勒及其优化方对家兔AS-PV 对MMPs 活性与表达的调节作用，探讨额尔敦-乌日勒及其优化方抗AS-PV 的作用机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 额尔敦-乌日勒［9］：内蒙古蒙药股份有限公司;国家准字：Z15020410;规格：2g/10 粒，30 粒/瓶;生产日期：2012-07-12;产品批号：120706;有效期：至2015-06。额尔敦-乌日勒优化方：与额尔敦-乌日勒同样标准。辛伐他汀片：山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司;国家准字：H20083840;生产日期：20121007;规格：20mg/片，12 片/1 板，板/盒;有效期：20141006。青霉素钠注射液：华北制药股份有限公司;国家准字：H13020655;生产日期：20120716;规格：160 万单位/瓶×50 瓶/盒;有效期：201406。肝素钠注射液，d 津生物化学制药有限责任公司;执行标准：国家准字：H12020505 生产日期：20121007;规格：1.25 万单位/2ml，2ml /支，2ml ×10 支/盒;有效期：20141006。3%戊巴比妥纳注射液，胎牛血清白蛋白(Albumin Bovine fraction V)：上海生物工程有限公司，鸡蛋黄、猪油、胆固醇：北京爱普华美生物科技有限公司生产，批号：20120715;血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)测试盒均购自南京建成生物技术有限公司。Trizol 试剂来源invitrogen，货号15596-026;DEPC 处理水试剂来源上海基尔顿生物，货号BYL40387;氯仿HPLC 级试剂、异丙醇HPLC 级试剂、无水乙醇AR 级试剂来源均购自上海国药集团;SYBRGreen PCR 试剂盒来源Thermo，货号F-415XL;逆转录试剂盒来源Thermo，货号#K1622。

1.2 动物 健康新西兰白兔，雄性，体重(2.0 ±0.2)kg，90只。由北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂提供(许可证编号：SCXK(京)2012-0005，防疫合格证号20120038)，试验在内蒙古医科大学蒙药研究院动物实验中心完成。实验条件：(18 ±2)℃，相对湿度(40 ± 15)%。

1.3 主要仪器 日立7180 型全自动生化分析仪：制造商—日本株式会社日立高新技术(日本国东京港区西新桥—丁目24 盘14 号);球囊扩张导管(人用)：导引导管规格：145cm×0.84mm，导引导丝规格：145 ×0.36mm，球囊规格：20 ×2.5，テルモ株式会社(日本)，REF/コ—ド番号：DC-RH2520EHW，LOT/制造番号：120209，有效期：2015-01］;压力泵：规格：20ml 美国麦瑞，PL303 电子d 平，国内dna 扩增仪：1109 型北京新技术所机械臂变温水浴电子调温40 ×0.5ml，国外dna 扩增仪：dna thermal cycler perkin –elmercetus(美)变温铝块压缩机致冷48 × 0. 5mlus $20000.-。试剂储存、标本制备和基因扩增与产物分析一起用品：2-8℃和-15℃冰箱，混匀器，微量加样器(覆盖1-1000μl)，移动紫外灯(近工作台面)，高速台式冷冻离心机，超声波水浴箱或加热模块，全自动定量核酸扩增仪(含计算机、打印机)。消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)。TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器制造厂;旋涡振荡器：上海青浦泸西仪器厂XW-80A;手握式电动匀浆机：德国FLUKO(F6-10);低温冷冻离心机：Sigma(3K15);移液器：吉尔森P 型移液器(Pipetman);Real- time 检测仪：ABI (ABI-7300)。酶标仪：芬兰(Labsystems Multiskan MS)，仪器型号：352 型;洗板机：芬兰(Thermo Labsystems)，仪器型号：AC8;离心机：微量高速离心机(国产)，仪器型号：TG16W;培养箱：隔水式恒温培养箱(国产)，仪器型号：GNP-9080型。

2 方法

2.1 家兔分组喂养 取90 只家兔，所有均单笼喂养，普通饲料适应性喂养1wk 后，按抽签法随机分为正常对照组(10 只)与造模组(80 只)。正常对照组喂普通饲料，每只予150g·d-1，造模组喂高脂饲料(1.0%胆固醇、5.0%猪油、5.0%蛋黄粉、89%基础饲料)，每只予150g(普通饲料50g、高脂饲料100g)·d-1，自由摄食，正常对照组与造模组分别灌胃蒸馏水，饮水不限，取材截止。

2.2 造模分组给药：造模组则采用下述方法建模。病变接近于人体不稳定斑块病变的发生发展过程的相对操作简单、造模成功率高、成本低、重复性好的建模方法［10］，将造模组选取采用复合因素(采用高脂饮食加免疫损伤和球囊拉伤方法)建模［11］，成功建立符合VP 病理形态学特征的动物模型。从实验第1wk 开始按造模组家兔喂养法给予高脂饲料，取材截止。第2wk 时(高脂饲料1wk 后)予造模组家兔经耳缘静脉一次性注射牛血清白蛋白250 mg/mL/kg。第4wk 行经股动脉球囊拉伤术，术前12 h 禁食不禁水，以3%戊巴比妥钠30 mg/kg 经耳缘静脉麻醉后将动物固定于手术台。左侧腹股沟wk 边区域剪毛常规皮肤消毒，沿股动脉走行切开皮肤，分离皮肤和皮下组织，分离股动脉约2 cm。结扎动脉远端，用手术丝线提起动脉近心端阻断近端血流。在动脉壁上约呈450“v”形剪开一小口，逆行插入肝素生理盐水(1：15 稀释)冲洗过的球囊导管(内置钢丝引导)至胸主动脉处。送入约20cm，抽出导丝，连接于50 mL 注射器，注入约20-30 mL 空气，使球囊内压力达到约2 个大气压。维持此状态缓慢拉出导管至其10cm 刻度处，然后回抽注射器解除球囊内压力，即有较强的阻力感继而突然的落空感即可。重新插入导管，再牵拉1 次，以确保内膜拉伤，反复2 次后撤出导管，结扎近心端。逐层缝合皮下组织和皮肤，青霉素钠注射液冲洗创面。约8wk(确定模型成功后)将造模组随机分为模型组(20 只)，额尔敦-乌日勒组(20 只)和额尔敦-乌日勒优化方组(以下称为：优化方组)(13 只)，辛伐他汀组(15 只)。分别给予相应药物干预，给予额尔敦-乌日勒及其优化方组家兔各0.4g/kg/d;给予辛伐他汀组家兔各5mg/kg/d。继续予以高脂饮食，24wk 取材截止。

2.3 收集标本：取材前12h 禁食，用3%的戊巴比妥钠30 mg/kg 经兔耳缘静脉麻醉后，固定于手术台上，用50 mL 注射器体外心脏采血，3000 r/min 离心10 min 后提取血清，血清贮存于-80°C 冰箱中备用;备用;经耳缘静脉空气栓塞处死家兔，取其主动脉、心脏、肝脏和肾脏等器官脏器，常规处理，为它项检测备用。

2.4 统计学分析：应用SPSS 13.0 统计软件进行数据统计学处理。采用ANOVA 方差分析并行方差齐性检验，两组均数间比较采用t 检验，结果以均数加减标准差(±s)表示，以P＜0.05 为有显著性差异。

3 结 果

3.1 一般状况：每d 喂养、灌药观察当中，家兔除了用于预实验和死亡以外，其余正常对照组家兔：精神状态良好，行为活动、反应灵敏，毛色较白有光泽，目睛光亮有神，饲喂时不断抓挠食盒，摄食、饮水、粪便未见明显异常。模型组家兔：从5wk 左右开始发现精神欠佳，目光呆滞，活动少，饮食可;8wk 左右饲喂时较少有反应，喜卧少动，饮食有所减少，毛色变暗;10wk 左右发现目睛混浊，可见有脂肪沉积，饮食略有增加;至12wk 时精神差，对外界刺激反应迟钝、多寐、饮食尚可、余同前。30d 称体重一次，模型组与正常对照组体重随时间变化呈增长趋势，但同一时间点两组间体重比较差别不大，无统计学意义(P＞0.05)。可以证实此造模因素基本未影响模型兔的正常生长，见表1。

表1 正常组与模型组家兔体重比较(±s，㎏)

表1 正常组与模型组家兔体重比较(±s，㎏)

注：模型组与正常对照组比较，P ＞0.05

组类 样本数 第一个月 第二个月 第三个月 第四个月正常组9 2.5 ±0.20 2.83 ±0.17 3.22 ±0.16 3.61 ±0.31模型组19 2.5 ±0.14 2.91 ±0.18 3.36 ±0.19 3.97 ±0.16

3.2 血清MMPs 活性检测结果 采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)法检测出各组家兔血清MMP-1、MMP-2、MMP-9 的活性，见表2。

表2 各组家兔基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)活性的比较(μg/L，± s)

表2 各组家兔基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)活性的比较(μg/L，± s)

注：模型组与正常组比较，* P ＜0.05;各给药组与模型组比较，△P ＜0.05;与辛伐他汀组比较﹟P ＜0.05。

组别MMP1 MMP2 MMP9正常组n 12.320 ±0.1508 21.855 ±2.349 61.900 ±7.673模型组 8 19.291 ±0.2459* 27.505 ±0.438* 65.564 ±0.676*辛伐他汀组 8 13.939 ±0.1961△ 23.488 ±0.435△ 59.485 ±0.930△额尔敦-乌日勒组 10 9.873 ±0.1269△﹟ 20.356 ±0.399△﹟ 54.072 ±0.535△额尔敦-乌日勒优化方组8 17.184 ±0.4459 25.645 ±0.338 63.463 ±1.235 8

图1 各组血清MMP-1 的活性指标比较图

各组家兔血清MMP-1 的活性指标比较：与正常组比较，模型组MMP-1 明显升高(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦-乌日勒组和辛伐他汀组明显降低(P＜0.05)，其中额尔敦-乌日勒组与辛伐他汀组间有显著性差异(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦-乌日勒优化方组无显著性差异。见图(1)和表2。

图2 各组家兔血清MMP-2 的活性指标比较图

各组家兔血清MMP-2 的活性指标比较：与正常组比较，模型组MMP-1 明显升高(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦-乌日勒组和辛伐他汀组明显降低(P＜0.05)，其中额尔敦-乌日勒组与辛伐他汀组间有显著性差异(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦-乌日勒优化方组无显著性差异，见图(2)和表2。

图3 各组家兔血清MMP-9 的活性指标比较图

各组家兔血清MMP-9 的活性指标比较：与正常组比较，模型组MMP-1 明显升高(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦-乌日勒组和辛伐他汀组明显降低(P＜0.05)，其中额尔敦-乌日勒组与辛伐他汀组间有显著性差异(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦-乌日勒优化方组无显著性差异，见图(3)和表2。

3.3 检测主动脉MMPs 基因表达结果：从各组随机取出家兔主动脉组织样本，采用实时定量荧光聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR)技术检测出MMP-1、MMP-2、MMP-9 的基因表达水平。各组家兔基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表达结果的比较如下：

表3 各组家兔基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表达的比较(± s)

表3 各组家兔基质金属蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表达的比较(± s)

注：模型组与正常组比较，* P ＜0.05;各给药组与模型组比较，△P ＜0.05;

分组MMP1 MMP2 MMP9正常组0.0202 ±0.0045 0.0238 ±0.0048 0.0057 ±0.0014模型组 0.0495 ±0.0063* 0.0519 ±0.0018* 0.0117 ±00.0022*辛伐他汀组 0.0290 ±0.0088△0.0243 ±0.0032△0.0073 ±0.0012△额尔敦-乌日勒组0.0285 ±0.0082△0.0232 ±0.0070△0.0069 ±0.0006△

图4 各组家兔主动脉MMP-1 基因表达水平比较图

各组家兔主动脉MMP-1 的基因表达水平比较：与正常组比较，模型组MMP-1 明显升高(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦-乌日勒组和辛伐他汀组明显降低(P＜0.05)，额尔敦-乌日勒组与辛伐他汀组间无显著性差异(P＞0.05)。见图(4)与表3。

图5 各组家兔主动脉MMP-2 的基因表达水平比较图

各组家兔主动脉MMP-2 的基因表达水平比较：与正常组比较，模型组MMP-2 明显升高P＜0.05;与模型组相比，额尔敦-乌日勒组和辛伐他汀组明显降低(P＜0.05)，其中额尔敦-乌日勒组与辛伐他汀组间无显著性差异(P＞0.05)。见图(5)与表3。

图6 各组家兔主动脉MMP-9 的基因表达水平比较图

各组家兔主动脉MMP-9 的基因表达水平比较，与正常组比较，模型组MMP-9 明显升高(P＜0.05);与模型组相比，额尔敦- 乌日勒组和辛伐他汀组明显降低(P＜0.05)，其中额尔敦-乌日勒组与辛伐他汀组间有显著性差异(P＞0.05)，见图(6)与表3。

4 小结

在成功建立造模基础上，分别给予相应药物干预，以辛伐他汀作对照，观察额尔敦-乌日勒及其优化方对实验性家兔AS-VP 的MMPs 的调节作用。实验结果显示，额尔敦-乌日勒能显著降低血清MMP-1、MMP-2 和MMP-9的活性，减少主动脉MMP-1、MMP-2 和MMP-9 的基因表达，表明额尔敦-乌日勒及其优化方对MMPs(MMP-1、MMP-2 和MMP-9)具有显著的调节作用，从本实验看，额尔敦-乌日勒及其优化方调节MMPs(MMP-1、MMP-2和MMP-9)活性作用可能优于辛伐他汀。因此，通过本实验，我们认为额尔敦- 乌日勒及其优化方可能通过降低MMPs(MMP-1、MMP-2 和MMP-9)活性和基因表达而起到稳定AS-VP 的作用。

［1］Naqhavi M，Libby P，Falk E，etal. From vulnerable plaque to vulnerable patient：A call for new defi nition and risk assessment strategies：part I［J］. Circulation，2003，108：1664-1672.

［2］许俊堂，胡大一. 动脉粥样硬化血栓形成［J］. 中国医刊.2006，41(7)：4-5.

［3］Morishige K，Shimokawa H，Matsumoto Y，et al . Over expression of ma2 trixmetalloproteinase-9 promotes intravascular thrombus formation in porcine coronary arteries in vivo［J］. Cardiovasc Res，2003，57 (2)：5722585.

［4］边小华. 治疗萨病的体会［J］.中国蒙医药，2010，(1)∶53.

［5］查干夫，塔娜.脑梗治验［J］.中国蒙医药，2010，(5)∶38.

［6］董平，麻春杰，都格尔，等.额尔敦-乌日勒对实验性家兔动脉粥样硬化的影响［J］.中华中医药学刊，2011，29(5)：1012，1015.

［7］麻春杰，都格尔，等.额尔敦-乌日勒在家兔动脉粥样硬化斑块消退中的作用及其对炎症因子的影响［J］. 世界科学技术—中医药现代化，2011，13(5)∶ 894-898.

［8］麻春杰，韩雪梅，图门巴雅尔，等.加减补阳还五汤和额尔敦-乌日勒对大白兔脑缺血的保护作用及血液流变性的影响［J］.中医药学刊，2002，20(2)：222，237。

［9］中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册［S］.1998，160。

［10］张军平，彭立，李良军，等.实验性兔AS-VP 模型的建立及评价［J］. 中国实验动物学报，2009，17(3)161-165。

［11］张军平，许颖智，李良军，等.实验性兔AS 模型复合建模的方法及评价［J］. 中国比较医学杂志，2009，19(1)：42-45。