王阳 邹明雷 吕晶晶 付培彪

[摘要] 目的 研究人胆管癌细胞在塞来昔布和放疗作用下发生凋亡的作用机制。 方法 将QBC939细胞株分为四组：对照组、塞来昔布组（C组）、放疗组（R组）和塞来昔布联合放疗组（C+R组，联合组），分别进行不同浓度的塞来昔布和不同剂量X线作用后，采用CCK-8法、流式细胞技术和Western blot等方法分别检测各组细胞生长、凋亡率及survivin蛋白的表达。 结果 联合组的凋亡率明显增加，从3.527%升至23.364%（P<0.05），survivin蛋白表达明显降低（P<0.05）。 结论 应用塞来昔布对接受放疗的人QBC939细胞株有凋亡增敏作用，下调survivin的表达是其机制之一。

[关键词] 塞来昔布；胆管细胞癌；放疗；survivin基因

[中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）10-0019-03

胆管细胞癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，因其解剖位置特殊，早期诊断较困难，可手术切除的患者不到20%，放化疗是中晚期患者主要治疗手段，但放疗效果受到肿瘤敏感性的限制。塞来昔布作为一种COX-2抑制剂，在近年研究中被认为具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[1，2]。本研究探讨体外条件下塞来昔布对接受X线放疗的人QBC939细胞凋亡的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料及细胞培养

QBC939人胆管癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，塞来昔布购自南京德宝生化有限公司，细胞培养基为含10%胎牛血清的1640培养基，兔抗人survivin多克隆抗体及β-actin购自Santa-Cruz公司，CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技研究所。细胞培养条件：37℃、5%CO2的培养箱。实验设计及研究时间2012年1月～2013年1月。

1.2 CCK-8法检测细胞生长

取传代培养的对数生长期QBC，939细胞制成1×105个/L细胞悬液，种植在96孔板中，每孔100 μL。设为调零组（不含细胞的培养液），对照组（常规培养细胞，不接受塞来昔布及放疗），实验组（分别加入浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L的塞来昔布，X线放疗剂量分别为2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy），实验组每组设10个复孔。培养48 h后实验组每孔加CCK-8试剂10 μL，再培养2 h后，用酶标仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度，计算细胞增殖抑制率，并进一步计算出塞来昔布的IC50=64.2 μmol/L。在后续实验中选择浓度65 μmol/L塞来昔布。X线放疗的IC50为5.83 Gy，选择剂量6 Gy用于后续实验。抑制率=（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

1.3 流式细胞术检测

将实验分为四组，每组样本数为10，分组设置如下：对照组单纯培养细胞；塞来昔布组（C组）加入浓度65 μmol/L塞来昔布；放疗组（R组）给予剂量6 Gy X线照射；塞来昔布联合放疗组（C+R组）先给予浓度65 μmol/L塞来昔布24 h后更换培养液，再给予剂量6 Gy的X线照射细胞，各组细胞均培养48 h，收集细胞并离心，按试剂盒说明书进行检测，凋亡细胞的比例由Cell Quest Pro 软件计算，实验重复3次。

1.4 Western blot蛋白检测

收集上述各组细胞，每组样本数为10，加入细胞裂解液，提取总蛋白，调整各组总蛋白，使各组总蛋白浓度相同。经15%SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜，封闭后加入一抗（兔抗人survivin多克隆抗体），工作浓度为1∶1000，再加入二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体），工作浓度为1∶6000。同样方法进行内参蛋白（β-actin）的抗体孵育。发光、显影、定影后制成胶片，扫描后用凝胶图像处理体统分析目标条带的净光密度值。

1.5 统计学分析

采用SPSS18.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的凋亡率

如图1所示每组细胞的流式图，结果显示联合组的凋亡率明显高于对照组、塞来昔布组及放疗组（P<0.05，见表1）。结合图1及表1结果，推断塞来昔布对QBC939的X线放疗有增敏作用。

2.2 Survivin蛋白的表达

联合组survivin蛋白表达较其他各组要明显减弱（图2），用相关软件计算出各条带的灰度值，将目的蛋白survivin/β-actin灰度值作为最终结果，以x±s表示（表1），多组之间比较差异有统计学意义（P<0.05），提示联合组survivin蛋白表达下降，从而加速细胞凋亡。

3 讨论

放射疗法作为治疗肿瘤的一种传统手段，其疗效受到肿瘤放疗敏感性的限制。目前研究发现大部分肿瘤对辐射并不敏感，在很大程度上影响了放疗效果。如何通过提高肿瘤的放射敏感性以提高放疗疗效，是近年来研究的热门之一。塞来昔布是一种环氧化酶-2（COX-2）选择性抑制剂，其放射增敏作用在近年研究中受到重视[2-4]。研究发现，环氧合酶-2（COX-2）在上皮组织癌（包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤的鳞状上皮细胞癌等）中广泛存在且过度表达，在肿瘤的发生、发展中起着重要作用[4]。COX-2促进前列腺素E2（PGE2）生成，而PGE2具有放射保护作用，而放射治疗在杀灭肿瘤细胞的同时诱导肿瘤细胞高表达COX-2[4，5]。塞来昔布属于非甾体类抗炎药（NSAIDs），是一种选择性环氧化酶抑制剂，可通过抑制环氧化酶-1及环氧化酶-2来阻止花生四烯酸向前列腺素转化，从而阻止PGE2的放射保护作用，发挥放射增敏剂的作用。研究发现，塞来昔布作为一种新型COX-2选择性抑制剂，可明显降低消化道肿瘤的发病率[4]，塞来昔布通过抑制肿瘤细胞放射损伤的修复，改变肿瘤细胞的周期分布，抑制肿瘤新生血管形成以及诱导肿瘤细胞凋亡等机制，在联合放射治疗可提高放疗疗效，增强肿瘤细胞对放射的敏感性[5-7]。聂亮琴[7]等将正常少突胶质细胞（oln93）及脑胶质瘤细胞（u373）分别按空白处理、单独接受塞来昔布或X射线、塞来昔布联合X射线4种不同处理方式研究塞来昔布的放射增敏作用及其作用机制，发现塞来昔布能抑制oln93细胞和u373细胞生长，胶质瘤细胞组放射增敏比高于正常胶质细胞组，并诱导胶质瘤细胞G0/G1期阻滞，联合组与照射组比较，u373细胞发生G2/M期阻滞，Cyclin B1、DNA-PKcs、MRE1l蛋白表达下降，提示塞来昔布对u373的放射增敏作用比oln93细胞明显，其机制与调节细胞周期分布及DNA损伤修复有关。

Survivin基因作为凋亡抑制家族的重要成员，是目前发现最强的凋亡抑制基因，survivin表达与肿瘤预后、放化疗敏感性密切相关[8-11]。survivin与环氧化酶-2表达的关系是塞来昔布作用机制研究的方向之一。夏历[12]等研究发现在胃癌组织中survivin的表达与COX-2相关。李伟忠等[13]通过研究环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞COX-2、survivin表达的影响及诱导细胞凋亡的作用，发现塞来昔布下调survivin mRNA及其蛋白表达的同时抑制COX-2蛋白的表达，但对COX-2 mRNA表达的抑制作用较弱，提示COX-2抑制剂塞来昔布下调survivin表达的作用可能与抑制肿瘤细胞生长等作用有关。方雷[14]等通过设计合成survivin 的 siRNA 序列并转染等方式研究survivin基因沉默对人胃癌MGC-803细胞增殖及对化疗药物塞来昔布敏感性的影响，发现 survivin基因沉默48 h后，MGC-803细胞的survivin基因和蛋白表达明显降低（P<0.05），survivin基因沉默组细胞对塞来昔布的敏感性显著增强，提示survivin特异性siRNA能显著沉默MGC-803细胞survivin基因，抑制细胞增殖，并增强MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。

使用塞来昔布来降低survivin的表达从而增加放疗的敏感性是本研究的设想之一。有研究发现在肝细胞癌中，PGE2可以激活EGFR/PI3K途径，通过EP1受体来上调survivin的表达[15]。本研究中，Western blot法检测到survivin蛋白的表达在联合组中明显下降，提示在QBC939细胞株中，塞来昔布可以加速survivin蛋白的分解或降低survivin的mRNA表达。本研究结果显示，联合组的凋亡率明显高于对照组、塞来昔布组及放疗组，由此我们可以推断，塞来昔布可以下调survivin表达，发挥放疗增敏作用。

本研究通过塞来昔布联合放疗作用于人胆管癌QBC939细胞株，显示塞来昔布能增强放疗的敏感性，提高肿瘤细胞凋亡率，其机制之一可能是抑制survivin表达。本研究对胆管癌的治疗提供了一种新思路，但是仍需更多研究来证实。

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（收稿日期：2015-01-09）