蒋晓丽 郭燕君 杨莉佳 王丹萍 黄文洁 董佳佳 徐营

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

卵母细胞孤雌激活及纺锤体形态改变*

蒋晓丽 郭燕君 杨莉佳 王丹萍 黄文洁 董佳佳 徐营△

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

目的：探讨不同激活方法小鼠卵母细胞孤雌激活的效率及纺锤体的变化。方法：小鼠卵母细胞采用乙醇、氯化锶化学激活，研究孤雌激活效果；采用免疫荧光染色法观察孤雌激活下卵母细胞纺锤体的动态变化。结果:(1)8%乙醇处理10、15 min的桑囊率高于处理5 min；(2)10 mmol·L-1氯化锶激活率高于2.5、5 mmol·L-1；(3)激活过程中纺锤体形态发生了改变。结论：8%乙醇处理时间相对延长有利于提高桑囊率；高浓度氯化锶激活效果较好；孤雌激活后纺锤体形态会发生改变。

卵母细胞；孤雌激活；纺锤体

小鼠卵母细胞及胚胎的发育与人类存在较多相似之处，是理想的实验对象，孤雌激活胚胎与精卵结合胚胎有相同的全能性和分裂能力，能够定向分化和发育[1]。虽然已有研究表明孤雌激活的小鼠胚胎存活且能发育成具有繁殖能力的成熟个体[2]，也有学者通过孤雌激活技术建立小鼠胚胎干细胞体系[3]，但是孤雌激活的小鼠胚胎很少能发育至足月出生，这可能与体外胚胎培养的环境设定密切相关。目前孤雌激活方法有电激活，化学激活，联合激活等。电激活因难以控制电场力、脉冲频率等受限，其产生的不适宜刺激也会影响胚胎分化发育。多种化学试剂联合激活的方式因其较高的激活效率而广为使用，但寻求高效的激活方法提高激活效率仍是目前研究的重点。本实验亦采用免疫荧光染色法，观察卵母细胞激活后染色体的动态改变。

1 材料与方法

1.1 材料

6-8周龄性成熟雌性ICR小鼠，约30 g·只-1，100只。自然条件下饲养，自由采食饮水。

1.2 方法

1.2.1 小鼠超数排卵和卵母细胞搜集

实验小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素10 IU·只-1，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素10 IU·只-1。于注射人绒毛膜促性腺激素后14-17 h颈椎脱臼处死小鼠，用眼科剪、眼科镊配合，无菌条件下分离输卵管，将输卵管置于无Ca2+CZB培养液中，在体视显微镜下刺破输卵管膨大部，释放卵丘卵母细胞复合体，用透明质酸酶(300 IU·ml-1)处理5-6 min，脱去卵丘细胞，获得卵母细胞。

1.2.2 实验设计和处理

1.2.2.1 8%乙醇处理不同时间

8%乙醇(无水乙醇配置)分别处理卵母细胞5 min，10 min，15 min，清洗5次后移入含有4 mg·L-1BSA的G1培养液中，于37℃，5% CO2培养箱培养，每日观察。

1.2.2.2 不同浓度氯化锶处理相同时间

分别使用2.5 mmol·L-1，5 mmol·L-1，10 mmol·L-1氯化锶的无Ca2+CZB中处理卵母细胞4 h，清洗5次后移入含有4 mg·L-1BSA的G1培养液中，于37℃，5% CO2培养箱培养，每日观察。

1.2.2.3 β-微管蛋白的免疫荧光染色

①固定：将孤雌激活后进入减数分裂的卵母细胞移入无钙、镁DPBS(Hyclone公司产品)配制的3.7%多聚甲醛中，室温(25℃)固定40 min或在40℃过夜。

②清洗：将固定后的样品移入清洗液中[含0.3%BSA(Roche公司产品)的DPBS]中清洗3次，每次5 min。

③透膜：将清洗后的样品移入透膜液[清洗液中加入0.2%TritonX-100(Amresco公司产品)]中，在37℃温箱中温育40 min，增加细胞膜的通透性，以利于抗体进入。

④清洗：将透膜处理后的样品移入含0.01% TritonX-100清洗液中清洗3次，每次5 min。

⑤封闭：每毫升清洗液中添加0.01125 g甘氨酸(Amresco公司产品)和10 mgBSA作为封闭液，37℃温育1 h。

⑥一抗结合：样品放入1:160封闭液稀释的小鼠抗β-微管蛋白的抗体(Monoclonal anti-β-tubulin，Sigam公司产品)中，37℃温育1 h。

⑦清洗：清洗液中清洗3次，每次5 min。

⑧二抗荧光标记：样品与1:100清洗液稀释的FITC标记的山羊抗鼠二抗(FITC-goat-antimouse IgG，Sigam公司产品)37℃温育40 min。

⑨清洗：清洗液中清洗3次，每次5 min。

1.2.2.4 PI染色

将经过微管染色样品清洗后，在含有15 μg·ml-1碘化丙啶(PI，Sigam公司产品)的清洗液中室温下温育10 min。

1.2.2.5 封片

在洁净的载玻片上，用凡士林：石蜡(9:1)混合物，根据盖玻片大小，在4个小柱的中央滴一滴防荧光淬灭剂(DABCO，Sigam公司产品)，将上述经PI染色后的样品在清洗液滴中稍清洗，立即移入防荧光淬灭剂中，将盖玻片轻放在4个小柱上，小心按压盖玻片，使样品位置固定，并稍扩展而不被压碎，用无色指甲油封片。

1.2.2.6 激光共聚焦显微术观察

在激光共聚焦显微镜下观察卵母细胞中β-微管蛋白的形态和分布情况，拍照记录。

2)保证支架合理工作状态。采取及时移架和限量放煤等方法，减少顶煤冒落，将支架顶梁仰俯角变化范围控制在±10°，防止后柱受力过小甚至出现拉力。

1.3 激活鉴定

判断卵母细胞激活的标准是形成一个原核、两个原核或出现两个极体。胞质破裂、核结构消失或结构损伤的卵母细胞归于退化。

1.4 观察、数据搜集

采用倒置荧光显微镜于激活后24 h观察并记录实验结果，后每日定时观察，直至胚胎体外培养至囊胚期，一般为4天左右。

1.5 统计学处理

所有数据进行χ2检验，均由SPSS17.0软件包处理。

2 结果

8%乙醇处理5，10，15 min的激活率相当，但10，15 min的桑囊率高于处理5 min者(x2=1.865，p=0.394)，见表1。

孤雌激活后纺锤体呈现与质膜平行、向细胞内部移动、消失三种形态变化。以下三图显示乙醇处理后纺锤体形态变化，见图1。

3 讨论

孤雌激活的目的是模拟精卵结合受精的过程，诱导内源性Ca2+升高，但其峰值常较精卵受精低，形成的单一Ca2+流只能降低细胞成熟促进因子(MPF)的活性而不能维持低水平的蛋白激酶(MAPK)，MPF、MAPK对于减数分裂至关重要[4]。也有报道显示老化的小鼠卵母细胞可自发孤雌激活，且不同老化时期的卵子随着老化时间延长，孤雌激活率明显增加[5]。自发孤雌激活亦是MAPK活性降低、MPF失活导致细胞衰老的主要表现之一[6]。

表1 8%乙醇处理不同时间对激活效率的影响

表2 不同浓度氯化锶处理对激活效率的影响

(a)纺锤体与质膜平行

(b)纺锤体向细胞内移动 (c)纺锤体消失

本实验研究了乙醇、氯化锶激活。乙醇(EH)是孤雌激活的试剂之一，其能水解卵母细胞膜上4,5-二磷酸肌醇(PIP2)生成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，改变卵母细胞膜的稳定性，诱导内源性Ca2+升高，增加肌浆网Ca2+释放以及外源性Ca2+内流[7]。从而形成类似受精作用下内源性Ca2+升高的现象，促进孤雌激活的进行。但是其激活效果并不高。本实验以8%的乙醇激活，时间设为5，10，15 min，三种情况下小鼠卵母细胞的孤雌激活率相当，但桑囊率并不高，与李光鹏、李子义等的报道相似[8]。

氯化锶被认为是较为有效的孤雌激活试剂[9,10]。其激活原理在于锶离子与钙离子为同族二价离子，锶离子能置换出肌质网中储存的Ca2+，引起卵母细胞胞质内多重Ca2+流，提高激活效率。本实验采用2.5 mmol·L-1，5 mmol·L-1，10 mmol·L-1氯化锶处理卵母细胞4 h，结果显示10 mmol·L-1的氯化锶浓度激活率前二者，但三种激活浓度下桑囊率均较低，这可能与氯化锶只能作用于孤雌激活的前期有关。

卵母细胞的成熟过程中，细胞器会发生一系列变化以保证减数分裂的正常进行，其中细胞骨架起着重要作用。细胞骨架是遍布于卵母细胞胞质中的一种复杂的蛋白质纤维网络，纺锤体是卵母细胞成熟中的一种主要细胞骨架成分，它是细胞的一种支撑结构，对细胞器的定位、生殖细胞的成熟、卵母细胞的受精起着重要的作用[13]，其完整性决定了染色体分裂的正确性，其正常生成则是染色体排列的必要条件。纺锤体生成后一般会有5-20 min的延迟，以供卵母细胞调整着丝点上微管束的极性，以及决定是否所有的着丝点都附着正确，纺锤体组装检查点(SAC)函数作为监测机制，能发现染色体错位和推迟后期，直到纠正错误。本实验通过对乙醇处理后纺锤体的免疫荧光染色检查，显示纺锤体与质膜平行，向细胞内部移动和消失三种不同的变化，当纺锤体与质膜平行时，减数分裂可继续进行[14]，而后两种变化势必会影响减数分裂过程中染色体的排列和向细胞两级移动，导致减数分裂不能正常进行，以致不能发育至囊胚期。

1 Han BS, Gao JL. Effects of chemical combinations on the parthenogenetic activation of mouse oocytes[J]. Exp Ther Med, 2013, 5(5): 1281-1288.

2 Kono T, Obata Y, Wu Q, et al. Birth of parthenegenetic mice that can develop to adulthood[J]. Nature, 2004, 428(6985): 860-864.

3 Lee ST, Choi MH, Lee EJ, et al. Establishment of autologous embryonic stem cells derived from preantral follicle culture and oocyte parthenogenesis[J]. Fertil Steril, 2008, 90(5): 1910-1920.

4 Jiang GJ, Wang K, Miao DQ, et al. Protein profile changes during porcine oocyte aging and effects of caffeine on protein expression patterns[J]. PLoS One, 2011, 6(12): e28996.

5 杨尚武,黄浩,王小婕,等. 小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究[J]. 中国计划生育学杂志, 2012, 20(11): 742-745.

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7 Machaty Z, Prather RS. Strategies for activating nuclear transfer oocytes[J]. Rep Rod Fertil Dev, 1998, 10(78): 599-613.

8 李光鹏,孟庆刚,魏鹏,等. 亚胺环己酮对猪卵母细胞人工激活作用研究[J]. 畜牧兽医学报, 2001, 32(5): 416-420.

9 杨红,陈建全,刘海峰,等. 应用氯化锶对小鼠卵母细胞孤雌活化的研究[J]. 中国实验动物学报, 2003, 11(3): 15-17.

10 李光鹏,魏鹏,孟庆刚,等. 应用氯化锶和放线菌酮对小鼠卵母细胞进行孤雌激活的研究[J]. 细胞生物学杂志, 1998, 20(2): 92-95.

11 Bai C, Liu Y, Wu X, et al. Diploid oocyte formation and tetraploid embryo development induced by cytochalasin B in bovine[J]. Cell Reprogram, 2011, 13(1): 37-45.

12 李光鹏,孟庆刚,魏鹏,等. 蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 动物学报, 2001, 47(6): 684-690.

13 Shen J, Wang Z, Shen X, et al. Abnormal dynamic changes in β-tubulin in somatic nuclear transfer cloned mouse embryos[J]. Zygote, 2015, 23(1): 76-82.

14 张庆华,单智焱,关娜,等. 小鼠孤雌胚早期发育过程中γ-微管蛋白的动态变化[J]. 生理学报, 2008, 60(6): 777-782.

Parthenogenetic action of oocytes and the change of spindle*

Jiang Xiao-li, Guo Yan-jun, Yang Li-jia, Wang Dan-ping, Huang Wen-jie, Dong Jia-jia, Xu Ying△

(Medical College of Jiaxing University, Zhejiang Jiaxing 314001)

Objective：To evaluate the efficiency of mice oocytes parthenogenetic activation by different activation methods and the change of the spindle. Method: Oocytes were obtained from mice ovaries. Parthenogenetic activation effect of mouse oocytes were researched after activation by ethanol, strontium chloride chemical activation. Oocytes dynamic changes of the spindle were observed by immunofluorescence staining after parthenogenetic activation. Results: (1) Mulberry sac rate of 8% ethanol processing 10, 15 min is higher than the treatment 5 min; (2) the strontium chloride activation rate for 10 mmol·L-1is higher than 2.5, 5 mmol·L-1; (3) Spindle shape has changed during the process of activation. Conclusion: Relative to extend the processing time of 8% ethanol is beneficial to increase mulberry sac rate; High concentrations of strontium chloride activation effect is better; spindle morphology changes after parthenogenetic activation.

Oocyte; Parthenogenetic activation; Spindle

浙江省大学生科技创新项目(编号：2014R417002)和嘉兴市科技计划项目(编号：2013AY21046)资助

蒋晓丽，女，本科在读，Email：570813426@qq.com。

Δ通讯作者：徐营，男，教授，主要从事胚胎学研究，Email：563031020@qq.com。

2015-3-23)