史文潮 施劲松 蒋 松 邱丹丹 王 晓 刘志红



利用肾小球全基因组表达数据筛选治疗糖尿病肾病的药物

史文潮 施劲松 蒋 松 邱丹丹 王 晓 刘志红

目的：利用2型糖尿病肾病(T2DN)患者微分离的肾小球全基因组表达数据，借助关联性图谱(CMAP)数据库和生物信息学方法，探寻具有T2DN治疗作用的潜在药物。 方法：选取中国汉族T2DN患者23例和正常对照6例，微分离肾小球，利用Affymetrix U133 Plus 2.0全基因组表达谱芯片检测获得基因表达数据，获得T2DN患者不同分期之间的差异表达基因后，进一步通过2种不同的生物信息学方法寻找T2DN的潜在治疗药物，并阐明其可能的分子作用机制。 结果：利用T2DN晚期和早期相比的差异表达基因和CMAP数据库，筛选出小白菊内酯(parthenolide)、荜茇酰胺(piperlongumine)、15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)和LY-294002(PI3K抑制剂)等候选药物。上述药物能够逆转T2DN患者在疾病进展过程中肾小球基因表达的变化，提示这些药物可能具有治疗T2DN的潜能。既往研究证实这些药物对T2DN有一定的治疗作用，验证了该药物筛选方法的可靠性。 结论：利用T2DN患者肾小球全基因组表达谱和CMAP数据库能够快速筛选出具有T2DN治疗潜能的药物，候选药物可进行下一步的动物实验和临床试验以证实其治疗的安全性和有效性，应用前景广阔。

糖尿病肾病 全基因组表达谱 关联性图谱 药物筛选

2型糖尿病肾病(T2DN)为复杂的多因素疾病，多种环境和遗传因素参与了T2DN的发生和发展，使其具有复杂、多维的分子通路及调控网络。目前研究认为T2DN与高血糖、血流动力学异常、代谢异常、炎症因子和氧化应激等密切相关[1]。作为严重危害人类健康的疾病，其治疗方式却很有限，大部分的T2DN治疗仍以控制血糖、血脂，降低血压及改善血流动力学等对症治疗为主，缺乏针对其分子机制的靶向性治疗药物。

全基因组表达数据是利用高通量的基因表达检测芯片所获取的组织或细胞的mRNA表达数据，不同病理生理状态下的组织或细胞的全基因组表达数据蕴含了疾病发生的分子机制信息。全基因组表达数据不仅用于复杂疾病的分子机制研究，近年来，利用全基因组表达数据和关联性图谱(CMAP)数据库寻找疾病分子靶点药物成为一个新的研究热点[2-3]。鉴于此，本研究首次利用中国汉族人群T2DN患者微分离肾小球的全基因组表达谱数据，应用生物信息学方法寻找新的治疗T2DN的候选药物。

对象和方法

研究对象 前瞻性入组2012年1月至2012年10月在南京军区南京总医院肾脏科行肾活检明确诊断为T2DN的患者23例。入组标准：(1)符合1997年世界卫生组织(WHO)2型糖尿病诊断标准；(2)病理形态学改变为光镜下肾小球体积增大，系膜区增生样改变，或肾小球节段硬化，少细胞结节(K-W结节)形成等；免疫荧光染色为寡免疫复合物沉积；(3)排除其他继发性肾脏疾病；(4)有完整的临床、病理及实验室检查记录。T2DN患者根据入组时24h微量蛋白尿定量或24h尿蛋白定量，以及血清肌酐(SCr)指标分为早期组：患者24h微量白蛋白尿定量(UAE)<0.5 g/24h,SCr<109.62 μmol/L，肾活检证实存在糖尿病肾病典型病理表现，即入组标准(2)中所述；晚期组:血清肌酐SCr>109.62 μmol/L，蛋白尿水平不限。患者的基线临床指标见表1。

正常对照组：前瞻性入组2012年1月至2012年10月在南京军区南京总医院泌尿外科，诊断明确为肾癌的患者6例。入选标准：(1)尿常规、尿沉渣及24h尿蛋白定量阴性；(2)年龄<60岁；(3)血常规和血生化无明显异常；(4)临床无明显消瘦等恶液质表现；(5)患者的空腹血糖、餐后血糖和糖化血红蛋白水平正常。

肾脏标本收集、肾小球微分离、提取RNA、放大并标记、芯片杂交扫描 根据标准操作流程完成肾组织标本的收集[4]，肾小球的微分离，RNA的提取、放大、标记和芯片杂交扫描。芯片原始数据用R语言和Bioconductor包进行质控和预处理，所有样本均通过质控，然后用RMA算法预处理(log2转换)得到信号矩阵，并对芯片探针进行注释，将其对应到相应的基因。去除没有对应基因或者有多个对应基因的探针，合并对应相同基因的多个探针，取中位数，最终得到29个样本20 110个基因的表达矩阵。

表1 糖尿病肾病患者的基线临床资料

BMI：体质量指数；eGFR：估算的肾小球率过滤；HbA1c：糖化血红蛋白；BUN：血清尿素氮

基因差异表达分析 利用R语言limma包，将T2DN整体、早期、晚期的基因表达值分别和对照组比较，并且将晚期组与早期组比较，寻找各组间的差异表达基因。差异表达基因定义为错误发现率(FDR)<0.05并且倍数改变大于1.5倍。选择晚期组与早期组比较的差异表达基因进行下一步的T2DN治疗药物筛选。

利用KS检验算法筛选药物 从CMAP数据库网站(http://www.broadinstitue.org/cmap)下载基因探针排序表(基于Kolmogorov-Smirnov statistic)，提取其中的基因探针共22 283个，与Human U133 Plus 2.0芯片的54 675个探针取交集得到22 277个共同探针，构建23个样本22 277个探针的信号矩阵。将上一步差异表达分析中变化最大的1 000个探针，其中上调881个，下调119个，分别保存为grp文件。登陆CMAP数据库网站，提交上调和下调的探针，运行得到结果。

利用匹配算法筛选药物 从CMAP数据库网站下载基因探针排序数据，其包含了6 100个药物干预实验产生的所有基因表达(芯片探针值)变化的排序。将探针转化成对应的基因符号，对应同一个基因的探针序号用中位数合并，然后从这张表中分别提取每个干预导致表达量升高和下降幅度最大的各500个基因。T2DN治疗药物应当能够逆转T2DN患者肾小球中基因表达的变化，即药物干预实验产生的基因表达变化应当与疾病组织基因表达变化相反。通过公式计算每个药物干预实验评分Scoredi=[(up∩downdi)+(down∩updi)]-[(up∩updi)+(down∩downdi)]

(Scoredi：药物干预i的得分；up：疾病组织的表达上调基因；down：疾病组织的表达下调基因；updi：药物干预i的表达上调基因；downdi：药物干预i的表达下调基因)

重新构建只包含CMAP数据库基因的T2DN表达矩阵，用R语言limma包找到T2DN晚期组和早期组的差异表达基因，通过公式计算得分，寻找治疗DN的候选药物。

基因富集分析 利用R语言“GeneAnswers”包(基于Fisher精确检验)对T2DN晚期和早期的差异表达基因及候选药物逆转的基因进行富集分析，包括基因本体论(Gene ontology,GO)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，进一步探讨疾病的发病机制和药物的作用机制。

统计方法 采用R语言进行数据分析，计量资料以均值±标准差表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。计数资料以百分比表示，多组间比较采用fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。基因差异表达分析采用基因数据的线性模型(Linear Models for Microarray Data,limma)，多重检验校正采用BH(Benjamini-Hochberg)法，FDR<0.05表示基因表达的差异有统计学意义。

结 果

DN差异表达基因 相较于正常对照组，T2DN患者肾小球中有1 054个基因出现明显差异表达，其中上调627个，下调427个。进一步将早期组和晚期组分别与对照组比较，共有132个基因在T2DN早期患者和对照组之间出现差异表达，其中上调63个，下调69个；共有2 333个基因在T2DN晚期患者和对照组之间出现差异表达，其中上调1 410个，下调923个。

T2DN晚期与早期相比，共有1 631个基因存在差异表达，其中上调1 128个，下调503个； GO分析和KEGG通路分析提示细胞外基质、发育、免疫、细胞黏附、细胞外基质受体相互作用、补体系统、细胞因子受体相互作用通路PI3K-Akt信号通路等出现异常(图1)。

图1 糖尿病肾病晚期和早期比较差异表达基因的GO分析(A)和KEGG通路富集分析(B)纵坐标是富集的GO分类或者KEGG通路；横坐标是FDR(BH校正后的P值)的lg值；右侧数字是差异表达基因中属于该分类或者通路的数量

CMAP药物筛选结果 我们将T2DN晚期组同早期组相比存在显著升高和降低的探针分别输入CMAP数据库，表2显示了在药物干预试验中，对T2DN差异表达基因逆转效果最为显著的20种药物(Score最接近于-1)。这些药物包括，蛋白酶体抑制剂MG-132[5]；PI3K抑制剂荜茇酰胺(piperlongumine)和LY-294002；过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)激动剂15-脱氧前列腺素J2(15-delta prostaglandin J2,15d-PGJ2)；核因子κB(NF-κB)抑制剂荜茇酰胺(piperlongumine)和小白菊内酯(parthenolide)；组蛋白去乙酰化酶抑制剂小白菊内酯和曲古抑菌素A(trichostatin A)； 肾上腺素α2受体拮抗剂育亨宾(yohimbine)。

表2 逆转2型糖尿病肾病(T2DN)基因表达变化的药物

序号：按评分升序排列；评分：反映药物对T2DN差异表达基因的影响，负值表示药物逆转T2DN基因表达的变化

匹配法药物筛选结果 我们进一步的利用匹配算法，输入DN晚期组同早期组相比存在显著差异表达的基因，获得了CMAP数据库中纳入的每种药物的评分，药物的评分见表3，其中列出了评分最高的20个。结合既往文献，我们对这些药物的作用进行了鉴定和分类，包括：NF-κB抑制剂小白菊内酯、荜茇酰胺和醉茄素A (withaferin A)；组蛋白去乙酰化酶抑制剂小白菊内酯、丙戊酸(Valproic acid)和伏立诺他(Vorinostat)； PI3K抑制剂荜茇酰胺和LY-294002；PPARγ激动剂15d-PGJ2；转录因子SP1抑制剂醉茄素A；磷酸二酯酶抑制剂白藜芦醇(resveratrol)等。

药物逆转基因功能分析 对筛选出的4种药物所逆转的基因进行GO分析和KEGG通路分析(图2)。功能分析显示小白菊内酯逆转的基因涉及细胞应激、免疫、NOD样受体信号通路和Toll样受体信号通路等(图2A,B)；荜茇酰胺逆转的基因涉及免疫、细胞应激、Toll样受体信号通路、补体系统、NF-κB信号通路和PI3K-Akt信号通路等(图2C,D)；15d-PGJ2逆转基因涉及细胞增殖和细胞因子受体相互作用通路等(图2E,F)；LY-294002逆转基因涉及细胞信号转导、细胞应激、组织发育和补体系统等(图2G,H)。

表3 单个干预药物的评分

评分：按照公式1计算出的评分；逆转：药物干预和2型糖尿病肾病导致基因表达变化方向相反；增强：药物干预和2型糖尿病肾病导致基因表达变化方向相同

图2 药物逆转基因的GO分析(A、C、E、G)和KEGG通路分析(B、D、F、H)纵坐标是富集的GO分类或者KEGG通路；横坐标是FDR(BH校正后的p值)的lg值；右侧数字是逆转基因中属于该分类或者通路的数量；A、B：小白菊内酯；C、D：荜茇酰胺E、F：15d-PGJ2；G、H：LY-294002

讨 论

本研究结合CMAP数据库用KS检验与匹配算法寻找能够逆转T2DN肾小球中差异表达基因的药物。两种方法筛选出的结果相互验证，可进一步增强药物的可靠性，为下一步的体内、体外研究提供良好的基础。

我们对全基因组表达数据进行了共表达分析并与临床指标进行相关性分析发现，T2DN患者和对照组相比，一部分差异表达基因的表达变化与DN的疾病分期和预后均无相关性，为了排除这部分基因的干扰，我们选择了T2DN晚期组与早期组相比的差异表达基因，利用KS检验算法和匹配算法这两种不同的生物信息学方法寻找可逆转差异表达基因的药物。

本研究筛选出的这4种药物涉及的主要作用机制包括抑制NF-κB[6]、抑制组蛋白去乙酰化酶[7]、抑制PI3K信号通路[8]及激活PPARγ[9]。这些机制在T2DN的发生发展过程中发挥了重要作用。

小白菊内酯是NF-κB抑制剂[10]，同时也是组蛋白去乙酰化酶抑制剂[11]。小白菊内酯抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖、NF-κB活化和单核细胞趋化蛋白1的表达[12]，抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞炎症因子水平[13]。荜茇酰胺是NF-κB抑制剂[14]，同时也是PI3K/Akt信号通路抑制剂[15]。荜茇酰胺是荜茇根提取物中的主要成分，某些印度部落用荜茇根治疗糖尿病[16]，在STZ糖尿病大鼠模型中，荜茇根提取物能够降低空腹血糖，保护肝肾功能，降低血清尿素和SCr[16]。15d-PGJ2作为PPARγ内源性配体，能够调节脂肪代谢，降低胰岛素抵抗[17]；在小鼠肾间质成纤维细胞中降低转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的纤维化，通过阻断TGF-β1/Smads信号通路降低α-平滑肌动蛋白、结缔组织生长因子、3型胶原和纤维连接蛋白的表达[18]。LY-294002是第一个人工合成的PI3K/Akt信号通咱抑制剂[19]。在人肾近端小管上皮细胞中，抑制高糖刺激引起的内皮细胞迁移、增殖和血管功能障碍[20]；抑制高糖刺激引起的系膜细胞1型胶原表达[21]；在db/db小鼠中降低Akt和FoxO3a的磷酸化水平，增加超氧化物歧化酶表达，减轻氧化应激[8]。

本研究利用T2DN患者肾小球全基因组表达谱和CMAP数据库，通过生物信息学方法寻找治疗T2DN的药物。该方法能够快速筛选出具有T2DN治疗潜能的药物，进一步的文献分析也验证了该方法的可靠性。本研究筛选的药物可进行下一步的动物实验和临床试验，以证实其治疗的安全性和有效性，具有广阔的应用前景。

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(本文编辑 律 舟 人 正 莫 非)

Exploration of potential drugs for diabetic nephropathy with the genome-wide expression data

SHIWenchao,SHIJingsong,JIANGSong,QIUDandan,WANGXiao,LIUZhihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210016，China

LIUZhihong(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

Objective：To investigate potential drugs for diabetic nephropathy (DN) using whole-genome expression profile and the Connectivity Map (CMAP). Methodology：Twenty three Chinese Han DN patients and six normal controls were included in this study.Whole-genome expression profiles of micro-dissected glomeruli were measured using the Affymetrix human U133 plus 2.0 chip.Differentially expressed genes (DEGs) between late stage and early stage DN samples and CMAP database were used to identify potential drugs for DN using bioinformatics methods.The molecular mechanisms of the potential drugs were also investigated. Results：Parthenolide, piperlongumine, 15d-PGJ2 and LY-294002 were predicted to maximally reverse the disease-associated expression of genes in glomerular of DN patients.Additional literature analysis of published researches showed that these drugs had therapeutic potential for DN. Conclusion：Using whole genome expression profiles and the CMAP database, the potential drugs for DN were rapidly predicted, and therapeutic potential was confirmed by previously published studies.Animal experiments and clinical trials are needed to confirm both the safety and efficacy of these drugs in the treatment of DN.

type Ⅱ diabetic nephropathy whole-genome expression profile CMAPdrug screening

国家科技支撑计划项目课题(2013BAI09B04,2015BAI12B05),江苏省自然科学基金项目(BK2012054)

南京大学医学院附属金陵医院(南京军区总医院)肾脏科 硕士研究生(史文潮),国家肾脏病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

刘志红(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

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2015-01-23