张子健,江建梅,舒 媛,吴 振

(唐山拓普生物科技有限公司,唐山市生物工程技术研究中心,河北唐山 063000)

高核糖核酸啤酒酵母菌QH633菌体制备工艺优化

张子健,江建梅,舒 媛,吴 振

(唐山拓普生物科技有限公司,唐山市生物工程技术研究中心,河北唐山 063000)

本文主要通过在摇床发酵条件下对啤酒酵母菌QH633的接种量、发酵温度、转速、发酵时间进行单因素实验,优选最适参数范围,再通过响应面分析法对其发酵工艺进行优化。优化后的发酵工艺为:发酵温度28℃,接种量10.50%,转速为203r/min,发酵时间16.5h,在此条件下,QH633的RNA含量为12.66%,与理论预测值基本符合,与初始发酵条件时的9.38%相比,增加了34.97%。

高核糖核酸酵母,工艺优化,响应面分析法,RNA含量

高呈味核苷酸酵母抽提物(Yeast Extract,简称YE),由于其低盐、纯天然、呈味性能优良等特点,逐渐被食品调味行业所青睐[1-2],该产品的制备要求原料具有较高的核糖核酸(RNA)含量。因此,如何提高酵母细胞中的RNA含量成为酵母深加工行业研究的热门。

近些年来,国内外专家学者对提高酵母菌体的RNA含量做了很多研究,也取得了一定的进展[3-8],但是由于其研究目的大多以RNA提取为主,专门针对高呈味核苷酸YE开发的研究较少；且研究内容主要集中在产朊假丝酵母和热带假丝酵母等,这些菌株虽然RNA含量较高,但是并非对人体和动物完全无毒副作用[9-12],而啤酒酵母,属于酿酒酵母属,被广泛认为是安全无公害的。本文主要针对高核糖核苷酸啤酒酵母的发酵工艺进行优化,旨在为酵母的深加工提供可行性依据,为啤酒酵母的综合利用及新产品的开发提供基础研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株:QH633(经由唐山拓普生物科技有限公司诱变选育而得)。

材料:硫酸铵、葡萄糖、氯化钠,磷酸二氢钾、盐酸、高氯酸,氯仿(均为分析纯)；酵母抽提物(唐山拓普生物科技有限公司自主生产)。

仪器:高压蒸汽灭菌锅BXM-30R 上海博讯；洁净工作台 上海博讯；高速冷冻离心机 赛默飞；全温振荡培养箱 荣华RH-Q；数显恒温水浴锅 金怡HH-8；数显鼓风干燥箱 嘉程GC101；紫外可见分光光度计 尤尼柯UV-2102C；电子天平；旋涡混合器。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配方 经前期正交实验,确定培养基的最佳配方为:葡萄糖2%,硫酸铵2.50%,酵母浸膏0.50%,磷酸二氢钾0.15%,氯化钠1.0%,pH5.0。

1.2.2 菌体制备工艺中参数的优化

1.2.2.1 接种量优化 按照接种量为5%、10%、15%、20%对QH633进行接种,在28℃下,150r/min振荡培养22h后,测定RNA含量、核酸总量和OD600nm值,优选最适接种量。

1.2.2.2 发酵温度优化 选取15、20、25、30℃四个不同的温度,以1.2.2.1所得的最适接种量接种,150r/min振荡培养22h,测定RNA含量、核酸总量和OD600nm值,优选最适温度。

1.2.2.3 发酵转速优化 在最适接种量、最适温度下,转速分别设为100、150、200、250r/min,振荡培养22h,测定RNA含量、核酸总量和OD600nm值,优选最适发酵转速。

1.2.2.4 发酵时间优化 在最适接种量、最适温度和最适转速下振荡培养12、14、16、18、20、22h测定RNA含量、核酸总量和OD600nm值,优选最佳发酵时间。

1.2.2.5 响应面实验设计 在单因素实验中挑选最适范围,通过响应面分析法对QH633的培养工艺进行优化,以RNA含量为测定指标,确定QH633的最佳培养工艺。

表1 Box-Behnken因素水平编码表Table 1 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

1.2.3 测定方法

1.2.3.1 啤酒酵母RNA含量和核酸总量测定方法 使用高氯酸法[9],经过改良。将发酵好的酵母菌离心,稀释至3mL,并测定其固形物含量w,称取1.000±0.002g菌悬液到大试管中,加入10%的高氯酸5mL,置于100℃的水浴锅中加热30min,然后置于冰水中冷却,以10000r/min离心20min。取上层的清液2mL,加入400μL氯仿,剧烈震荡2min,10000r/min离心10min,吸取1mL上清液,加入到经高温灭菌的无菌水试管中稀释至10-2梯度,旋涡混匀,以10%高氯酸为空白,在260nm下测核酸的吸光度。

酵母RNA含量(%)=(OD260/0.024×上清液体积×6)/(m×w)×100

核酸总量(mg/100mL)=(OD260/0.024×上清液体积×6×3)/1000

式中:0.024是浓度为1μg/mL的RNA溶液的OD值。

1.2.3.2 菌数的测定方法 将酵母悬液在600nm下测定吸光度值,OD600nm可反映菌株生长情况。

1.3 数据统计分析

每次实验重复三次,单因素实验数据采用Excel 2003处理,响应面实验数据采用Design Expert 8.0软件进行回归和方差分析。p<0.05为差异显著,p<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 接种量

由图1可知,QH633的RNA含量先随接种量的提高而增加,接种量为10%时,QH633的RNA含量达到最大值,为10.07%,随接种量继续提高,RNA含量反而降低,接种量20%时RNA含量仅为8.73%。此外,接种量为10%时,QH633菌数较为适中,发酵液的核酸总量较高,为8.49mg/100mL,因此,接种量控制在10%进行接种发酵,其效果最佳。

图1 QH633接种量优化Fig.1 Inoculation quantity optimization for QH633

2.2 温度

由图2可知,在15℃和20℃时进行发酵,QH633的RNA含量分别为10.42%和11.15%,但是其菌体浓度太低,核酸总量仅为1.95mg/100mL和2.79mg/100mL,不利于工业上的应用生产；25℃进行发酵时,菌体RNA含量达到10.27%,菌体量增加明显,核酸总量较高,为8.63mg/100mL；而30℃时的QH633的RNA含量仅为8.72%,这有可能是因为温度为30℃时,酵母细胞衰老加速,开始出现自溶现象[10]。因此,25℃为最佳的发酵温度。但是,由于在工业生产中普遍采用28℃和30℃作为酵母菌发酵的温度,本研究中28℃时的RNA含量为10.07%(见2.1),更为接近最佳温度,为更好地为工业化生产服务,本文不再对温度进行优化,均采用28℃为最适发酵温度。

图2 QH633温度优化Fig.2 Temperature optimization for QH633

2.3 转速

由图3可知,QH633的RNA含量先随转速的提高而增加,转速控制在200r/min时,QH633的RNA含量最高,为10.80%,这是由于转速提升使得摇瓶中的溶氧量增加,菌体分裂增殖迅速,且可以避免产生对酵母生长不利的乙醇。从而促进了菌体中RNA的合成,而转速为250r/min时,RNA含量降为10.16%,这有可能是因为转速过大,菌体间碰撞过于剧烈,导致细胞破损,RNA含量降低[7]。此外,转速控制在200r/min时,QH633菌数较为适中,核酸总量较高,为8.92mg/100mL,因此200r/min为发酵最佳转速。

图3 QH633转速优化Fig.3 Rotation rate optimization for QH633

2.4 时间

由图4可知,随着发酵时间的增加,QH633的RNA含量也逐渐增加,发酵16h时,QH633的RNA含量最高,为12.11%,随着发酵不断进行,RNA含量不断降低,到22h时,RNA含量降为10.72%。这可能是由于在对数生长期菌体进行有丝分裂,RNA成双倍出现在单个细胞中,此时的RNA含量最高,随后细胞分裂,菌体数量增加,RNA含量则因分母的增加而降低,因此,发酵时间应严格控制在菌体对数生长期内[13]。此外,发酵16h时,QH633菌数较为适中,核酸总量较高,为8.15mg/100mL,因此16h为发酵的最佳时间。

图4 QH633时间优化Fig.4 Time optimization for QH633

2.5 响应面分析

参照文献[14-15],利用Design Expert 8.0软件,采用中心组合实验Box-Behnken设计方案,进行3因素3水平的响应曲面工艺优化实验,因素水平编码表见表1。实验共设17个实验点,包括12个析因点和5个中心点,结果如表2所示。利用Design Expert 8.0软件对表2实验数据进行回归分析,经回归拟合后,各因素与响应值的回归方程为:

Y=12.53+0.18A+0.087B+0.49C-0.21AB-0.10AC+0.060BC-0.78A2-0.61B2-1.99C2

其中：Y-RNA含量(%)；A-接种量(%)；B-转速(r/min)；C-时间(h)。

表2 Box-Behnken设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 方差分析表Table 3 ANOVA analysis for regression equation

根据方差分析和回归方程,得到三维响应曲面图(图5～7)。考察所拟合的响应曲面的形状,分析接种量、转速和发酵时间对RNA含量的影响。

通过模型预测,QH633菌体富集RNA的最优工艺为:接种量为10.50%,转速203r/min,发酵时间16.5h,RNA含量预测值为12.57%。用优化后的条件进行了三次验证性实验,以保证预测值不偏离实际值,RNA含量平均为12.66%,实验值与预测值吻合良好,这表明模型能较好的预测实际RNA含量。

图5 转速和接种量对RNA含量影响的响应曲线Fig.5 Response curve of rotation rate and inoculation quantity on the content of RNA

图6 时间和接种量对RNA含量影响的响应曲线Fig.6 Response curve of time and inoculation quantity on the content of RNA

图7 时间和转速对RNA含量影响的响应曲线Fig.7 Response curve of time and rotation rate on the content of RNA

3 结论

通过单因素实验和Box-Behnken中心组合设计

原理以及响应面分析法对啤酒酵母的发酵工艺进行了优化,拟合了接种量、转速和发酵时间这3个因素对RNA含量的回归模型,经检验证明该模型合理可靠,能较好的预测啤酒酵母的RNA含量,由该模型确定的最佳工艺条件为发酵温度28℃,接种量10.5%、转速203r/min、发酵时间16.5h。通过模型系数显著性检验,得到的因素主效应关系为发酵时间>接种量>转速。经三次验证实验,RNA含量可达12.66%,相较初始发酵条件下的RNA含量9.38%,增加了34.97%。

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Optimization of cell preparation technology forhigh RNA content Beer Yeast QH633

ZHANG Zi-jian,JIANG Jian-mei,SHU Yuan,WU Zhen

(Tangshan TOP Bio-technology co.,ltd.,Tangshan Engineering Research Centre for Biological,Tangshan 063000,China)

In this paper,we studied the inoculation quantity,the fermentation temperature,the rotation rate and the fermentation time,as the single factor for QH633 fermentation experiment in shaking flask fermentation conditions. Then we selected the optimal parameters,and optimizated the fermentation process through the response surface analysis. The optimal fermentation conditions as follows:fermentation temperature 28℃,inoculation quantity 10.50%(v/v),revolution speed 203r/min,fermentation time 16.5h. Under this condition,the RNA content of QH633 was 12.66%,consistented with the predicted value,and compared with 9.38% of the initial fermentation conditions,increased by 34.97%.

high RNA content yeast;process optimization;response surface analysis;RNA content

2014-05-27

张子健(1984-)，女，硕士，工程师，研究方向：食品微生物。

国家国际科技合作专项项目(2012DFA30390)资助。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0178-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.028