葛 飞,石贝杰,龚 倩,昂安娜,李婉珍,桂 琳

(1.安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000;2.皖南医学院微生物与免疫学教研室,安徽芜湖 241000)

响应面法优化草菇液态发酵菌丝体中总三萜的微波提取工艺

葛 飞1,石贝杰1,龚 倩1,昂安娜1,李婉珍1,桂 琳2,*

(1.安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000;2.皖南医学院微生物与免疫学教研室,安徽芜湖 241000)

目的:利用响应面分析法对微波辅助提取草菇液态发酵菌丝体中总三萜工艺进行研究。方法:在单因素实验基础上,选取微波功率、提取时间、提取温度和液料比为影响因素,以草菇菌丝体中总三萜提取率为响应值进行响应面分析。结果:草菇液态发酵菌丝体中总三萜的最佳微波提取条件为微波功率720W、提取时间21min、提取温度66℃和液料比36mL/g。在此条件下,草菇菌丝体中总三萜提取率为1.65%。结论:采用微波技术提取草菇液态发酵菌丝体中总三萜的工艺稳定性好,提取率高。

响应面法,草菇,菌丝体,微波提取

草菇(Volvariellavolvacea)又名美味苞脚菇、兰花菇、中国菇等,在日本称为中华春占地、袋茸等,是一种名贵食用菌[1-3]。现代药理学研究结果表明,草菇具有抗氧化[4]、调节免疫[5-7]、抗肿瘤[8]等多种药理活性,具有很大的开发价值。

三萜(triterpenoids)是由30个碳原子组成的萜类化合物,有的以游离形式存在,有的则与糖结合成苷的形式存在(三萜糖苷)[2]。三萜类化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗生育、杀软体动物等生物活性[2,9]。

目前,草菇的加工利用还处于粗浅阶段,急需发展深加工技术[10],对草菇菌丝体中三萜类物质提取工艺的研究未见报道。本文利用单因素实验和响应面优化的方法,对草菇液态发酵菌丝体中总三萜的微波提取工艺进行了研究,为草菇液态发酵菌丝体的深度利用及其相关保健食品的开发提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种VolvariellavolvaceaSG32 安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心保藏。

1.1.2 主要试剂 齐墩果酸标准品 上海研域生物科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基 斜面培养基:蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L,酵母膏10g/L,琼脂20g/L,pH自然；液体摇瓶培养基:蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L,酵母膏10g/L,pH自然。

1.1.4 主要仪器设备 L5型紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；MAS-Ⅱ微波提取装置 上海市新仪微波化学科技有限公司；QHZ-123B组合式全温度振荡培养箱 江苏省太仓市华美生化仪器厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；L550型台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FreeZone12冷冻干燥系统 美国LABCONCO公司；WK-600A高速粉碎机 青州市精诚医药装备制造有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 草菇液态摇瓶培养 采用1.1.3液体培养基进行摇瓶培养。在温度为30℃,摇床转速150r/min的条件下闭光振荡培养9d,5000r/min离心20min后,双层纱布过滤获得菌丝体,将获取的菌丝体再经冷冻干燥后,粉碎,备用。

1.2.2 微波辅助提取草菇菌丝体中总三萜 准确称取草菇液态发酵菌丝体5.000g加入一定体积的75%乙醇,用微波提取装置辅助提取草菇菌丝体中总三萜。

1.2.3 草菇菌丝体中总三萜测定 测定方法按参考文献[11]进行。以齐墩果酸为标准品,齐墩果酸质量为横坐标,OD值为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程:A=0.007m-0.0034(R2=0.998)。上式中,m为齐墩果酸质量(μg),A为吸光度。

将1.2.2获得的提取液经适当处理后,在550nm处测OD值,根据标准曲线及测定OD值,计算草菇菌丝体中总三萜含量。

1.2.4 单因素实验设计

1.2.4.1 微波功率对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 选择提取时间为15min、提取温度60℃、液料比30mL/g,分别用300、400、500、600、700、800和900W的微波功率提取草菇菌丝体中总三萜,考察微波功率对菌丝体中总三萜提取率的影响。

1.2.4.2 提取时间对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 选择微波功率为700W、提取温度60℃、液料比30mL/g,分别提取5、10、15、20、25、30和35min,考察提取时间对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响。

1.2.4.3 提取温度对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 选择微波功率为700W、提取时间20min、液料比30mL/g,分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70和75℃条件下,进行草菇菌丝体中总三萜的提取,考察提取温度对总三萜提取效果的影响。

1.2.4.4 液料比对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 选择微波功率为700W、提取时间20min、提取温度65℃,分别在液料比为10、20、25、30、35、40和45mL/g条件下,进行草菇菌丝体中总三萜的提取,考察液料比对总三萜提取率的影响。

1.2.5 Box-Behnken实验因素水平设计 在单因素实验结果的基础上,采用BBD-RSM法设计优化草菇液态发酵菌丝体中总三萜的微波提取工艺参数。设计因素水平见表1。

表1 实验因素水平表Table 1 Levels and factors of experiment

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 微波功率对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 由图1可知,草菇菌丝体中总三萜提取率随微波功率的增加而增加；当功率超过700W时,继续增大微波功率对提取率影响较小；本实验中,当微波功率从700W增大到900W时,菌丝体中总三萜提取率仅增加了0.02%。结合能源消耗因素考虑,选择700W为较佳微波提取功率。

图1 微波功率对草菇菌丝体总三萜提取率的影响Fig.1 Effects of microwave power on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

2.1.2 提取时间对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 由图2可知,提取时间超过20min后,随着提取时间的增大,草菇菌丝体中总三萜提取率增加很小,几乎没有变化,将时间从20min延长到35min时,提取率仅增加了0.02%。因此,选择20min为较佳提取时间。

图2 提取时间对草菇菌丝体总三萜提取率的影响Fig.2 Effects of treatment time on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

2.1.3 提取温度对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 由图3可见,在30～65℃范围内时,随温度升高草菇菌丝体中总三萜提取率逐步提高；当温度高于65℃时,提取率反而略有减小。因此,确定较佳提取温度为65℃。

图3 提取温度对草菇菌丝体总三萜提取率的影响Fig.3 Effects of treatment temperature on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

2.1.4 液料比对草菇菌丝体中总三萜提取率的影响 由图4可知,在液料比小于35mL/g时,随料液比的增加,总三萜提取率增加明显；在液料比大于35mL/g后,总三萜提取率增加明显变缓；当液料比从35mL/g增加到45mL/g时,提取率仅增加了0.01%。从提取成本等因素考虑,确定较佳液料比为35mL/g。

图4 液料比对草菇菌丝体总三萜提取率的影响Fig.4 Effects of liquid-to-material ratio on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

2.2 Box-Behnken实验设计及分析

以总三萜提取率为响应值,用Design-Expert8.0.6.1软件对表2中的实验结果进行统计分析,可建立如下二次回归方程:Y=1.64+0.052A+0.11B+0.057C+0.053D+0.01AB+0.04AC+0.085AD+0.065BC-0.11BD-0.045CD-0.18A2-0.26B2-0.21C2-0.17D2。对二次回归方程进行方差分析,结果见表3。

由表3可知,回归模型达到极显著水平p<0.0001,而失拟项为0.0940,说明回归方程与实际情况吻合较好,误差较小,可信度较高。由F值大小可知,实验中各因素对草菇菌丝体中总三萜提取效果的影响大小为:B>C>D>A,即提取时间>提取温度>料液比>微波功率。另外,AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2对总三萜的提取率也有显著影响。因此,实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,二次项对三萜提取率也有很大影响。

表2 Box-Behnken响应面实验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 Box-Behnken Design响应面实验方差分析表Table 3 Variance analysis table of Box-Behnken

注:**代表p<0.01,极显著；*代表p<0.05,显著。2.3 响应面分析

运用Design-Expert8.0.6.1软件对回归模型进行响应面分析,得到微波功率、提取时间、提取温度和液料比四个因素两两之间响应面立体分析图如图5～图10所示。

图5 微波功率和提取时间交互作用 对草菇菌丝体总三萜提取率影响的响应面图Fig.5 RSD figures for the effects of microwave power and treatment time on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

图6 微波功率和提取温度交互作用 对草菇菌丝体总三萜提取率影响的响应面图Fig.6 RSD figures for the effects of microwave power and extracting temperature on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

图7 微波功率和液料比交互作用 对草菇菌丝体总三萜提取率影响的响应面图Fig.7 RSD figures for the effects of microwave power and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

图8 提取时间和提取温度交互作用 对草菇菌丝体总三萜提取率影响的响应面图Fig.8 RSD figures for the effects of treatment time and extracting temperature on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

图9 提取时间和液料比交互作用 对草菇菌丝体总三萜提取率影响的响应面图Fig.9 RSD figures for the effects of treatment time and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

图10 提取温度和液料比交互作用 对草菇菌丝体总三萜提取率影响的响应面图Fig.10 RSD figures for the effects of extracting temperature and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea

等高线图可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度,圆形表示两因素交互作用不显著、椭圆形表示两因素交互作用显著。由图5～图10可以看出,图5中等高线接近圆形,说明微波功率与提取时间两个因素交互作用不显著；图6～图10中的等高线均呈椭圆形,表明两者交互作用显著。

为确定各因素的最佳取值,用Design-Expert 8.0.6.1软件进行数值优化分析,得出回归模型存在最大值点,即最佳实验条件。经分析,最佳提取条件为微波功率719.40W、提取时间21.04min、提取温度65.88℃和液料比35.56mL/g。在此条件下,草菇菌丝体中总三萜提取率为1.668%。考虑实验的可操作性,将各工艺参数修正为微波功率720W、提取时间21min、提取温度66℃和液料比36mL/g。为验证模型的准确性,依据响应面分析获取修正后的最优工艺参数进行3次验证实验,结果菌丝体中总三萜平均提取率为1.65%,与理论预测值接近,说明获取的最佳工艺参数是可行的、有效的。

3 结论

微波技术作为近年来发展的一门新技术,它具有穿透力强、选择性高、加热速度快、控制方便、受热体系温度均匀、节约能量及不需要特殊分离步骤等优点[12]。本文以75%乙醇为提取溶剂,利用微波辅

助乙醇的方法对草菇菌丝体中总三萜进行提取,在单因素实验的基础上,以胞内总三萜得率为响应值,结合实验的可操作性,得出最佳微波萃取条件为微波功率720W、提取时间21min、提取温度66℃和液料比36mL/g,该工艺条件下总三萜提取率可达1.65%。该方法操作简便,稳定性好,效率高,为有效提取草菇菌丝体中三萜类物质提供了一定的参考依据。

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Optimal microwave extraction conditions of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by response surface methodology

GE Fei1,SHI Bei-jie1,GONG Qian1,ANG An-na1,LI Wan-zhen1,GUI Lin2,*

(1. Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation Anhui Province,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China;2. Department of Microbiology and Immunology,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China)

Objective:Optimal microwave extraction conditions of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by response surface methodology was studied. Methods:Based on single factor experiments,microwave power,treatment time,extracting temperature and liquid-to-material ratio as main variables that influence extraction efficiency were identified. With the value of the total triterpenoids yield in the mycelia,the extraction conditions was optimized by response surface analysis method. Results:The optimal microwave extraction conditions was determined as follows:microwave power 720W,treatment time 21min,extrcting temperature 66℃ and liquid-to-material ratio 36mL/g. Under these conditions,the average extraction rate of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia reached 1.65%. Conclusions:Compared with other extraction methods,the method of extracting total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by microwave technique was efficient and stable.

response surface methodology；Volvariellavolvacea；mycelia；microwave extraction

2014-04-08

葛飞(1978-),男,博士,副教授,研究方向：微生物资源、天然产物开发与利用。

*通讯作者:桂琳(1980-),女,硕士，副教授,研究方向：应用微生物学。

安徽省高等学校优秀青年人才基金项目(2011SQRL079)；安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2013A049)。

TS201.3

B

1002-0306(2015)03-0270-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.048