朱婷 聂青和 王媛媛 高禄化 龙振昼 李汨

目前，对于丙型肝炎尚无有效的预防性疫苗［1］。由于细胞受体是HCV入侵宿主细胞的门户，是抗病毒药物最佳靶点之一。因此，HCV受体一直是研究热点，它对于今后有效控制HCV感染及其药物的研发具有重要意义［2］。HCV受体主要包括CD81、B族I型清道夫受体（scavenger receptor class B typeI，SRBI）、紧密连接蛋白家族、低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）、树突状细胞特异性细胞间黏附分子－3－结合非整合素分子（DCSIGN）等［3］。研究表明，C型凝集素CLEC4M可能是介导HCV入胞的重要分子［4］。为此，本研究构建了GV166－CLEC4M慢病毒载体，使其在 Huh7.5细胞过表达，获得稳定过表达CLEC4M的细胞系，应用HCV体外培养系统，即体外培养的 HCV（cell cultured HCV，HCVcc）感染过表达 CLEC4M 的Huh7.5细胞，了解CLEC4M的表达对HCVcc易感性的影响。

资料和方法

一、材料

人肝癌细胞系Huh－7.5细胞、包含HCV全长序列的载体pFL－J6/JFH 由本室保存，GV166－CLEC4M慢病毒载体由本室构建并保存；DMEM、胰蛋白酶、FBS、NEAA购自美国Gibco公司；XBaI购自立陶宛MBI Fermentas公司、蛋白酶 K、RNA Marker RL 5000为TaKaRa公司产品；PageRulerTM 蛋白marker购自中国Fermentas公司；GenEluteDNA纯化试剂盒为美国Sigma公司产品；PureLink质粒小量提取试剂盒为美国Invitrogen公司产品；T7 AmpliScribe体外转录试剂盒为美国Thermo公司产品；RNeasy RNA Mini Kit为德国Qiagen公司产品，抗GFP多克隆抗体购自美国eBioscience公司，鼠抗人CLEC4M抗体、兔抗人HCV NS5a抗体、山羊抗兔IgG抗体购自英国Abcam公司，HCV荧光定量试剂盒购自深圳凯杰生物工程有限公司。

二、方法

（一）HCVcc的培养及感染测定 参照文献［5］。将 HCV pFL－J6/JFH－1（2a基因型）质粒10μL（浓度200 ng/μL），加入限制性内切酶 XbaI 2μL，37℃水浴，酶切3.5 h，使质粒线性化。按照GenElute DNA纯化试剂盒操作说明书，进行线性化DNA纯化。采用紫外分光光度计检测DNA纯化后的浓度。按照Thermo Scientific TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit操作说明对DNA模板进行体外转录，然后按照Qiagen RNeasy试剂盒操作说明，纯化RNA产物，测定浓度，分装。……