张斯汉，李荣亨，巫艳芬，潘富林，蔡威黔，陈 铿，罗光平，李萍华，黄 耿，陈薇薇，罗 宁*

·药学研究·

HPLC法测定复元胶囊三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量

张斯汉1，李荣亨2，巫艳芬3，潘富林1，蔡威黔1，陈 铿1，罗光平1，李萍华1，黄 耿1，陈薇薇1，罗 宁1*

目的 采用HPLC法检测复元胶囊中主要成分三七皂苷R1和淫羊藿苷的含量。方法 取3个不同批次复元胶囊各5粒，经溶解、醇提、萃取、过滤等处理后采用HPLC检测其含量，以地高辛为内标，获得药品和内标曲线下面积之比，按照标准曲线计算出三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量。结果 计算出每粒复元胶囊中三七皂苷R1的含量为12.18 mg/g，淫羊藿苷的含量为54.65 mg/g。结论 本实验HPLC方法可行，能准确检测复元胶囊中三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量。

复元胶囊；三七皂苷R1；淫羊藿苷；含量测定；HPLC

0 引言

复元胶囊是重庆医科大学李荣亨教授课题组研制的院内制剂，药效学、毒理学[1]及作用机制方面的文献证实该药能有效治疗骨关节炎，并对以气虚血瘀、肝肾不足为主要症候表现的老年病有确切疗效。

复元胶囊以淫羊藿补肾阳、祛风湿，三七活血行淤为君，人参、黄芪补气益精为臣。根据张文亮等[2]的研究，复元胶囊主要成分三七皂苷和淫羊藿苷均可显著降低uPA、NF-κB(P65)的mRNA表达量，保护软骨细胞免受炎症因子的损伤。鉴于复元胶囊的主要成分三七皂苷R1及淫羊藿苷是复元胶囊中治疗的有效成分，将其作为复元胶囊的质控指标，本实验采用高效液相色谱法对复元胶囊中2种成分的含量进行了测定。

1 试药与仪器

1.1 实验药品 复元胶囊，配方由重庆医科大学附属第一医院李荣亨教授提供，所有药材均购于重庆桐君阁药材批发公司，由重庆希尔安药业有限公司生产为胶囊,批号：A20130816、B20130922、C20131017。每粒胶囊重0．41 g，每克粉末相当于生药3 g。对照品：三七皂苷R1及淫羊藿苷(纯度>98%)，均购自中国药品生物制品检定所。内标：地高辛，购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈、正丁醇、石油醚均为分析纯，由北京瑞福伟达化工有限公司提供。

1.2 实验器材 高效液相色谱：安捷伦1200高效液相色谱仪,安捷伦公司。湘仪TG16-W微量台式高速离心机，湘仪离心机有限公司。XB220A电子天平，上海精科天平仪器厂。KPD-1004台式超声乳化仪，深圳市科普达机电设备公司。XW80快速混合仪，上海沪西分析仪器有限公司。

1.3 对照品储备液 精确称取三七皂苷R1及淫羊藿苷，用甲醇分别制成浓度为0.2 mg/mL和0.8 mg/mL的储备液，备用。

1.4 供试品储备液 随机取5粒复元胶囊，取内容物，混匀，精密称取0.2 g粉末，置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液，超声处理1 h，过滤，滤液加入石油醚萃取2次，再加入正丁醇萃取2次，挥干，加入甲醇5 mL，溶解，过滤，滤液超声处理1 h，通过0.45 μm微孔滤膜后40 ℃水浴氮气吹干，4 ℃保存，检测时用甲醇复溶1 mL备用。

2 实验与方法

2.1 色谱条件 色谱柱:岛津GL/SHIMADUZ-GL色谱柱(4.6 μm×250 μm)；梯度洗脱法，流动相包含乙腈-水，0～10 min：20%(乙腈含量百分比)，11～17 min：20%～46%，18～35 min：46%～55%；柱温28 ℃，流速1.0 mL/min；内标：200 μg/mL地高辛溶液。进样量100 μL,测定波长203 nm。

2.2 线性关系考察 精确量取储备液10、20、50、200、400 μL，加甲醇至1 mL，并加内标地高辛10 μg/mL。快速混匀，每次取20 μL进样，以三七皂苷R1及淫羊藿苷和内标的曲线下面积比为纵坐标(Y)，以进样量为横坐标(X)，模拟两条曲线方程：三七皂苷R1的线性回归方程为Y=0.088 75 X-0.017 5，淫羊藿苷的线性回归方程为Y=0.104 4 X+0.345。R=0.999 8，说明淫羊藿苷在8～320 μg/mL、三七皂苷R1在2～80 μg/mL范围内有良好的线性关系。

2.3 精密度 分别量取10、50、100 μL 3个浓度的三七皂苷R1和淫羊藿苷，日内每个浓度进5针，计算RSD，三七皂苷R1为1.28%，淫羊藿苷为1.06%；连续5 d每天进针1次，共5针，计算日间RSD，三七皂苷R1为1.35%，淫羊藿苷为1.17%。

2.4 稳定性和重复性 分别量取10、50、100 μL 3个浓度的三七皂苷R1和淫羊藿苷，室温(20 ℃)及冻融(-4 ℃)条件下检测药物峰和内标峰面积之比，计算RSD。室温下三七皂苷R1 的RSD分别为1.27%、1.43%、1.31%，淫羊藿苷的RSD分别为1.71%、1.45%、1.62%。

2.5 回收率试验 在已知浓度的三七皂苷R1和淫羊藿苷供试品溶液中，分别加入80%、100%、120%的标准对照品，每个浓度5份，HPLC检测三七皂苷R1及淫羊藿苷的含量，取5次检测平均值计算加样回收率(测得浓度-样品浓度)/加入浓度×100%。结果见表1。

表1 三七皂苷R1及淫羊藿苷加样回收率(μg，n=5)

2.6 三七皂苷R1及淫羊藿苷色谱图 见图1。

2.7 样品测定结果 取A、B、C 3个批次的复元胶囊，每个批次随机取5粒检测，结果见表2。

表2 复元胶囊中三七皂苷R1和淫羊藿苷含量(mg/g)(n=5)

3 讨论

中药三七含有三七总皂苷，由三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1组成。其中，三七皂苷R1和淫羊藿苷被证实在复元胶囊的治疗效应中发挥了重要作用[2-3]。药典记载，三七皂苷R1在203 nm处有最大紫外吸收光谱，能被HPLC的紫外检测器所检测[4]。同时，人参皂苷Rg1、Rb1在此处也有最大吸收峰，但是根据预实验结果，后两者出峰时间在25 min以后，基本上不会对三七皂苷R1的峰形造成干扰。淫羊藿苷最大紫外吸收峰在270 nm处，但是在203 nm处也有吸收。《中国药典》规定内标地高辛的检测波长为230 nm[5]，根据作者的预实验结果，其在203 nm处也有吸收。因此，本实验设定紫外检测器的检测波长为203 nm，能同时检测三七皂苷R1和淫羊藿苷的含量。采用内标法检测药物含量，能避免由于色谱方法学以及样品前处理过程中造成的误差，是一种相对精确的方法。同时，在本实验中，三七皂苷R1、淫羊藿苷及内标分别在不同的时间出峰，相互之间无干扰，峰形好，无拖尾，是同时检测复元胶囊主要成分三七皂苷R1及淫羊藿苷的科学、可靠的方法。

图1 色谱行为

[1] 刘婵娟,李荣亨,杨俊卿.复元胶囊的毒理学研究[J].重庆医科大学学报,2009,34(7):916-919.

[2] 张文亮,李荣亨,王淑美,等.复元胶囊对兔骨关节炎关节软骨uPA、uPAR、PAI及NF-κB表达的影响[J].第三军医大学学报,2011,33(20):2172-2176.

[3] 张文亮,李荣亨,王淑美,等.复元胶囊及其主要成分淫羊藿苷、三七皂苷R1治疗骨关节炎的分子机制研究[J].中国中药杂志,2011,36(15):2113-2117.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2005:10-11.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京:化学工业出版社,2005:181-182.

Determination of notoginsenoside R1 and icariin in Fuyuan capsule by HPLC

ZHANG Si-han1，LI Rong-heng2，WU Yan-fen3，PAN Fu-lin1，CAI Wei-qian1，CHEN Keng1，LUO Guang-ping1，LI Ping-hua1，HUANG Geng1，CHEN Wei-wei1，LUO Ning1*

(1.Shenzhen Longgang District People′s Hospital,Shenzhen 518172,China;2.The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;3.Shenzhen Longgang Hospital of TCM,Shenzhen 518172,China)

Objective To establish an HPLC method for the determination of notoginsenoside R1 and icariin in Fuyuan capsule.Methods 5 capsules from different batches of target medicine were detected by HPLC after dissolution,ethanol extraction,normal butanol extraction and filtration.Digoxin was as a interior label and the ratio of AUC targets/AUC digoxin were gotten.The contents were calculated by standard curve.Results The content of notoginsenoside R1 and icariin were 12.18 mg/g and 54.65 mg/g respectively.Conclusion The HPLC method in the study is feasible and the experiment data of contents are precise.

Fuyuan capsule;Notoginsenoside R1;Icariin;Content determination;HPLC

2014-08-15

1.深圳市龙岗区人民医院，深圳 518172；2.重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016；3.深圳市龙岗区中医院，深圳 518172

深圳市龙岗区科技局基金课题(YS2012125)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503016

*通信作者