刘振宁，郭治华，姚 民，赵 敏

·论著·

PPAR-γ受体激活对百草枯中毒致大鼠急性肺损伤的保护作用

刘振宁，郭治华，姚 民，赵 敏*

目的 研究PPAR-γ受体激活对百草枯中毒致大鼠急性肺损伤的保护作用。方法 48只SD雄性大鼠随机平均分成3组，A组(百草枯中毒组)：按照20 mg/kg剂量腹腔注射；B组(低剂量PPAR-γ受体激动剂罗格列酮预处理组)：在给予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射3 mg/kg 罗格列酮；C组(高剂量PPAR-γ受体激动剂罗格列酮预处理组)：在给予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射10 mg/kg 罗格列酮；D组(对照组)：1 mL生理盐水腹腔注射。在注射百草枯后24 h和72 h时，每组取出6只，收集血清和肺组织标本。采用Elisa方法检测血清中IL-1β和TNF-α含量测定，行组织切片HE染色进行肺损伤评分，利用Western blot方法检测肺组织中caspase-3和AP-1 蛋白表达水平，采用免疫组化方法检测caspase-3蛋白在肺组织中的表达。结果 大鼠百草枯中毒后血清炎性细胞因子IL-1β和TNF-α含量明显增加。肺湿重/干重比以及肺损伤评分明显增加。罗格列酮预处理组可以减轻肺组织损伤程度，降低血清中IL-1β和TNF-α含量，减少肺组织中caspase-3和AP-1 蛋白的表达。结论 应用PPAR-γ激动剂罗格列酮可以抑制百草枯中毒大鼠肺组织中caspase-3和AP-1 蛋白表达，抑制炎症反应和凋亡，对百草枯中毒导致急性肺损伤产生保护作用。

百草枯；急性肺损伤；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3；激活蛋白-1

0 引言

百草枯(Paraquat,PQ)中毒是临床急诊最常见的中毒之一。由于目前临床缺乏有效解毒剂以及有限的治疗手段，导致该病死亡率超过50%[1]。百草枯主要蓄积于肺泡细胞及细支气管细胞，激活炎性细胞，分泌炎性细胞因子，并产生炎症反应，导致急性肺损伤，最终表现为急性呼吸窘迫综合征和呼吸衰竭[2]。

转录因子激活蛋白-1(Activating protein-1,AP-1)[3]和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)[4]与细胞增殖凋亡和免疫反应等关系密切，参与许多炎症性疾病发生发展过程。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisome proliferator activated receptors,PPAR-γ)被激活以后，可以诱导其下游抗氧化酶表达，产生抗氧化作用[5]。此外，PPAR-γ受体激动剂还可以产生强大抗炎作用[6]。本研究采用PPAR-γ受体激动剂罗格列酮对大鼠进行预处理，然后观察百草枯中毒肺损伤改善情况，并进一步研究分析PPAR-γ受体的激活对caspase-3和AP-1 蛋白调控作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 罗格列酮,百草枯(Sigma-Aldrich，美国)；caspase-3，c-Fos，c-Jun和β-actin抗体(Santa，美国)；TNF-α和IL-1β Elisa试剂盒(R&D,美国)；SABC免疫组化试剂盒 (武汉博士德生物有限公司,中国)；其余均为进口或者国产分析纯化学试剂。石蜡切片机和包埋机(Leitz，德国)；电泳仪、半干转印仪(BIO-RAD，美国)；显微摄像系统(Q cupture prol Evolution ncp 5.01 BX51，日本)。

1.2 动物 清洁级雄性Sprague Dawley大鼠，体重200～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2003-0009,实验动物使用许可证号: SYXK(辽)2003-0013。大鼠适应性喂养1周，大鼠饲养的温度控制20～25 ℃、湿度控制40%～70%，昼夜节律控制12 h，自由进食水。该实验方案经过中国医科大学动物伦理委员会批准。

1.3 动物分组 将48只大鼠随机平均分成4组，每组12只，具体如下： A组(百草枯中毒组)：按照20 mg/kg剂量腹腔注射；B组(低剂量PPAR-γ激动剂罗格列酮预处理组)：在给予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射3 mg/kg 罗格列酮；C组(高剂量PPAR-γ激动剂罗格列酮预处理组)：在给予PQ腹腔注射前1 h腹腔注射10 mg/kg 罗格列酮；D组(对照组)：1 mL生理盐水腹腔注射。

1.4 标本的采集及保存 在百草枯腹腔注射后24、72 h时，每组取出6只大鼠，使用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉。待麻醉充分后，将大鼠仰卧于鼠台上固定，常规消毒后，打开胸腔，使用5 mL注射器刺入右心室，缓慢取血，避免溶血。将血放入10 mL离心管中，3 000 r/min、4 ℃，离心10 min，取上清分装至1.5 mL EP管中，每管放约0.5 mL，置-80 ℃冰箱保存。心脏采血后，剪掉左心耳，使用生理盐水冲洗肺组织，待清亮液体流出后，完整取出两侧肺组织，观察肺组织颜色，质地，有无出血等病理变化。生理盐水清洗后，将肺叶液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存用以备检测。

1.5 血清IL-1β和TNF-α含量测定 将收集的大鼠血清在4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集上清，使用ELISA方法严格按照说明书(R&D,美国)检测血清中IL-1β (31.25～2 000 μg/L)和TNF-α (12.5～800 μg/L)含量。

1.6 肺组织损伤评分 将固定好的大鼠肺组织切割组织块，至厚度约0.5 cm左右，常规组织梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片，行HE 染色。光镜下观察肺组织病理学变化，并按Mikawa等[7]方法进行肺损伤评分。评分标准如下：对①肺泡充血、②出血、③肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集、④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成四项指标，分别依病变轻重评0～4分(0：无病变或非常轻微,1:轻度病变,2:中度病变,3:重度病变,4:极重度病变)。各项评定分数相加为肺损伤总评分。

1.7 免疫组织化学染色 将肺组织切片用0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)漂洗2次，3%H2O2孵育15 min，PBS洗3次，3% Triton X-100孵育15 min。使用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)抗原修复15 min，滴加10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭游离的结合位点，室温20 min，以减少非特异性染色，倾去切片上血清，滴加1∶500稀释的兔抗鼠caspase-3抗体，4 ℃冰箱过夜。阴性对照以PBS代替一抗，4 ℃过夜。PBS洗3次，滴加生物素标记的山羊抗兔二抗工作液(1∶200)，室温孵育20 min，PBS洗3次,滴加SABC,室温20 min。PBS冲洗5 min×4次。DAB显色剂显色3 min左右，自来水充分冲洗终止显色。苏木素复染30 s，分色，二甲苯透明，晾干。中性树胶封片，显微镜下观察。

1.8 Western blot 法检测肺组织caspase-3和AP-1的表达 按照细胞核蛋白提取试剂盒说明，提取肺上皮细胞核蛋白，进行蛋白定量后，加样品缓冲液煮沸5 min，各取20 μL 加样；使用10% 聚丙烯酰胺凝胶在150 V、30 mA条件下电泳1.5 h；50 V 条件下PVDF 膜转膜2 h；5%脱脂牛奶封闭，滴加caspase-3一抗(1∶50)和c-Fos、c-Jun一抗(1∶100)，4 ℃过夜;用含0.1% Tween 20 的TBS 冲洗5 min × 3次，再加入二抗(1∶500)室温下孵育2 h，用0.1%TBST 冲洗15 min × 3 次，ECL 发光检测，X 线片显影，扫描图像，测得各条带的灰度值，以β-actin为内参标准后，比较其表达量的变化。

2 结果

2.1 大鼠血清IL-1β和TNF-α含量测定 在百草枯中毒24 h和72 h时，大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量较正常对照组明显增加。经过罗格列酮预处理以后大鼠血清中二者均有下降趋势，高剂量组则较为明显，与百草枯中毒组比较差异有统计学意义。如图1-A、B所示。

图1-A 不同组别大鼠在24 h和72 h时血清IL-1β含量

图1-B 不同组别大鼠在24 h和72 h时血清TNF-α含量

2.2 大鼠肺组织损伤评分 大鼠正常肺组织肺泡结构完整清晰，而百草枯中毒72 h时肺组织光镜下可见肺泡结构破坏，肺泡内出血，肺间质水肿，大量炎性细胞浸润。使用高剂量罗格列酮预处理以后，中毒大鼠肺损伤程度明显减轻，计算肺损伤评分明显下降，与百草枯中毒组比较差异有统计学意义(*P<0.05)。如图2所示。

图2 不同组别大鼠肺组织损伤评分

2.3 caspase-3蛋白在大鼠肺组织中的表达 caspase-3蛋白在正常大鼠肺组织中支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞存在极少量表达。百草枯中毒以后其表达量明显增加，当使用罗格列酮激活PPAR-γ以后，其表达量则明显减少，如图3所示。

2.4 caspase-3和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在肺组织中的量化分析 Western blot 结果提示，caspase-3和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在百草枯中毒组中表达较正常组明显增加。当使用PPAR-γ激动剂罗格列酮预处理以后二者表达明显下调，与百草枯中毒组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。如图4所示。

图3 caspase-3蛋白在不同组别大鼠肺组织中的表达(IHC,×200)

3 讨论

百草枯进入机体以后很快被吸收入血，在肺组织聚集，造成肺损伤，然后通过肾脏进行代谢。目前对于百草枯导致肺损伤的机制不是非常明确，除了脂质过氧化反应之外，炎症反应和凋亡均参与了百草枯诱导的肺损伤。病理学表现为肺泡结构破坏，大量粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润，释放大量炎性细胞因子和趋化因子参与炎症反应。TNF-α和IL-1β是导致细胞或组织损伤的主要细胞因子，在炎症的发生发展过程中起到极其重要的生物学作用。其分泌和表达除了可以促进巨噬细胞的分化成熟，还可以行程复杂细胞网络，形成复杂的细胞网络引起肺损伤。临床研究发现，百草枯中毒患者血清中细胞因子如IGF-1、TNF-α和IL-10等均明显高于正常人群[8]。与临床发现的结果类似，本实验研究发现百草枯中毒大鼠，血清中的炎性细胞因子如(IL-1β和TNF-α)均有明显增加。

图4 不同组别大鼠肺组织caspase-3和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白表达

转录因子AP-1是由 c-fos 和 c-jun 蛋白组成的同源或异源二聚体，参与调控很多炎性细胞因子的表达[9]。在外界条件作用，c-jun和c-fos 表达水平增高，并转变为c-fos、c-jun 异源二聚体并引起下游细胞因子的转录合成。研究发现，提取慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)患者外周血单核细胞，c-Fos和c-Jun表达水平明显升高，可能与COPD炎症过程中炎性细胞因子高表达有关[10]。caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶。国外有学者研究发现,大鼠百草枯中毒以后，随着时间的推移肺组织凋亡细胞比例逐渐增多，caspase-3和caspase-8表达明显增多，分析原因可能与百草枯导致线粒体功能障碍，导致凋亡的发生[11]。本实验研究提示百草枯中毒大鼠肺组织中AP-1 和caspase-3表达明显高于正常。说明百草枯导致AP-1的激活，引起包括IL-1β和TNF-α在内多种细胞因子的激活；caspase-3的激活导致细胞凋亡的发生。炎症反应和凋亡效应两者相互影响相互作用，进一步扩大了百草枯对细胞的损伤和毒性效应。

PPAR-γ在炎症控制和免疫调节发面发挥重要的作用[12]。PPAR-γ直接与NF-κB和AP-1结合形成转录抑制性复合物，阻止转录因子活化从而使下游细胞因子表达减少[13]；此外，PPAR-γ活化可以抑制中性粒细胞浸润[14]，减少炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的分泌，进而抑制单核细胞在肺组织中的趋化聚集[15]。动物实验研究发现，PPARγ激动剂罗格列酮可能通过上调 Bcl-2 表达,下调 Bax 和 caspase-3 表达,抑制肝脏细胞凋亡，从而对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用[16]。本实验也证实在百草枯致大鼠肺损伤的过程中，使用高亲和力配体罗格列酮激活PPAR-γ受体以后，可以抑制AP-1和caspase-3的活化，进而抑制炎性细胞因子的表达，减少细胞的凋亡。

综上所述，PPAR-γ的激活对百草枯中毒致肺损伤产生保护作用，分析原因可能与抑制AP-1和caspase-3的活化有关，进而抑制炎症反应和凋亡，具体分子机制还须要进一步研究。

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Protective effect of PPAR-γ receptor activation on acute lung injury induced by paraquat poisoning in rats

LIU Zhen-ning,GUO Zhi-hua,YAO Min,ZHAO Min*

(Department of Emergency Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To study the protective effect of PPAR-γ receptor activation on acute lung injury induced by paraquat poisoning in rats.Methods 48 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups.Group A (paraquat poisoning),paraquat was administered intraperitoneally at the dose of 20 mg/kg;Group B (low dose PPAR-γ agonist rosiglitazone pretreatment),rosiglitazone (3 mg/kg,ip)was administered 1 h before PQ exposure pretreatment group;Group C (high dose PPAR-γ agonist rosiglitazone pretreatment),rosiglitazone (10 mg/kg,ip)was administered 1 h before PQ exposure pretreatment group；Group D (control),1 mL normal saline was administered intraperitoneally.The concentration of TNF-α and IL-1β in venous blood was measured via Elisa at 24 h and 72 h after PQ exposure.The lung injury scores and caspase-3 positive signal were detected and analyzed at 72 h after PQ exposure via HE staining and immunohistochemistry respectively.Caspase-3 and AP-1 protein expression were also determined by using Western blot.Results The levels of IL-1β and TNF-α in the peripheral blood of PQ-treated rats were significantly increased compared with control group.Caspase-3 positive signal were detected in the lung tissues of PQ-treated rats.PPAR-γ receptor activation could attenuate lung tissue damage;decrease the caspase-3 and AP-1 protein expression compared with the PQ group.Conclusion PPAR-γ receptor activation can inhibit caspase-3 and AP-1 protein expression in lung tissue,attenuate inflammation and apoptosis,and exert a protective effect against paraquat-induced acute lung injury.

Paraquat;Acute lung injury;Caspase-3;AP-1

2014-11-12

中国医科大学附属盛京医院急诊科，沈阳 110004

国家自然科学基金资助项目(81171793/H1503);卫生部国家临床重点专科建设项目(2012-649)；辽宁省教育厅高等学校科学研究一般项目(L2014300)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503001

*通信作者