刘楠，万强，陈跃

基于国产18F多动能模块的3-脱氧-3-[18F]氟代胸苷的快速自动化合成*

刘楠，万强，陈跃

（四川医科大学附属第一医院核医学科，四川泸州646000）

目的：利用国产18F多功能合成模块，摸索更优的18F-FLT合成方法，为临床提供一种简单，快速的全自动合成18FFLT的方法。方法：首先用无水正己烷清洗Sep-Pak QMA柱，再以四乙基碳酸氢铵为相转移催化剂将18F-淋洗至反应管，以3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧-3’-O-(4-硝基苯磺酰基-β-1)-苏戊呋喃糖]胸腺嘧啶为前体，经亲核、水解、中和三步反应后利用Sep-Pak小柱分离制备得到18F-FLT注射液。结果：成功利用全自动方法合成了18FFLT，总时间为25～30 min，未校正收率为10%～15%，放化纯与化学纯均大于95%，18F-FLT与19F-FLT在分析型HPLC上的保留时间为14.3 min，通过TLC检测，Rf约为0.7。结论：发展了一种可靠的，简单有效的18F-FLT合成方法，该方法提供了一种快速的18F离子干燥法，并通过Sep-Pak小柱纯化获得高放化纯与化学纯的18F-FLT注射液。

18F-FLT；柱纯化；自动化合成；放射合成

正电子断层扫描是一种在肿瘤诊断，分期以及治疗方面非常有效的手段。虽然18F-FDG是目前应用最广泛的肿瘤显像剂,但其对肿瘤缺乏特异性，所以在临床应用中仍有诸多的不足[1]。18F-FLT(3’-deoxy-3’-[18F]fluorothymidine是一种胸腺嘧啶核苷类似物，是目前临床上使用最多的一类反映细胞增殖的正电子显像剂。18F-FLT在体内的显像原理与18F-FDG类似，在增殖细胞内，18F-FLT通过胸苷激酶-1（TK-1）磷酸化为([18F]FLT-5’-PO4，进而滞留并在细胞内积聚，而肿瘤细胞具有快速增殖的特点，因此18F-FLT能够反映细胞增殖情况，对于肿瘤的早期诊断、鉴别诊断、疗效监测及预后等方面具有重要的价值，并且在部分疾病的诊断上（例如：肺癌和脑瘤）具有比18F-FDG更高的诊断准确率[2]。

考虑到18F-FLT在临床上的重要意义，因此有必要建立一些高效可靠的合成方法以满足临床需要。自从1991年首次报道18F-FLT的合成以来[3]，研究人员就不断对其合成方法进行改进。但是，传统的18F-FLT的合成仍面临诸多问题，比如合成时间长（多为60 min左右），后处理复杂等（需要通过半制备HPLC进行纯化）。

18F-FLT的制备主要涉及到18F-的捕获、洗脱、亲核反应与后处理。在过去的几十年，研究主要集中于新型前体的研发与亲核反应的条件改进[4-6]，但对于反应前的除水干燥阶段以及反应后处理阶段的研究还不多，而这两个过程在整个标记反应中会用掉20～30 min，这也是导致放射活性大量损失的主要原因之一（18F-的半衰期为109.7 min）。考虑到完全的除水干燥不易掌握以及半制备HPLC柱子上产品吸附较多等问题[7-8]，近年来研究人员为进一步提高反应效率，缩短合成时间，也逐渐对这两个过程重视起来。研究发现[8-10]，通过使用无水有机溶剂清洗QMA小柱，再使用含有相转移催化剂的有机溶剂将18F-从QMA小柱上洗脱，可以有效的缩短除水时间，利用此法已成功合成18F-FDG，18F-FDR等多种18F示踪剂。而对于反应的后处理，国内的文富华等[11]利用Sep-Pak SCX小柱，Sep-Pak Al2O3小柱与Sep-Pak C18小柱成功实现了18F-FLT的快速纯化，虽然放化纯＞95%，但张锦明[12]等发现其化学纯并不令人满意。2014年，有学者[13-14]通过增加洗脱剂的极性，成功获得了高放化纯与化学纯的18F-FLT注射液。本研究尝试利用国产18F多功能模块，通过缩短除水时间，采用柱分离纯化法纯化产品，探索高效快速合成18F-FLT的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

H218O：丰度95%，德国ABX产品；无水乙腈；无水正己烷；四乙基碳酸氢铵（TEABC）：美国Sigma公司产品；Sep-Pak QMA；Sep-Pak Al2O3柱；Sep-Pak IC-H柱；Sep-Pak C18柱：美国Waters公司产品；NBoc前体：江苏华益化工有限公司产品；NaOH和HCl：均为国产试剂。SIEMENS Eclipse HP/RD回旋加速器：德国西门子公司产品；MF-2V氟多功能合成模块：派特(北京)科技有限公司产品，配有放射性检测器、半制备HPLC、UV IS200紫外分光光度计(Alltech公司)；半制备HPLC柱Grace Alltima C-18 (250 mm×10 mm)；分析型HPLC与TLC检测器：Lab Alliance高效液相色谱仪系统（天津兰博公司）

1.2 国产18F多功能模块的准备（图1）

图1 18F-FLT合成路线图

本工作采用的国产18F多功能模块虽然含有18F-FLT的合成程序，但为了适应本项研究，需要对模块管线重新进行连接。首先将B的液体输出端与A瓶连接并在前端连接单向阀，避免气体倒灌入B瓶，将V17阀与中转瓶连接起来，在V15阀与V17阀之间依次连接Sep-Pak IC-H柱与Sep-Pak Al2O3柱，V22阀与V23阀之间连接Sep-Pak C18小柱。

1.3 试剂准备

在18F-从加速器传入模块之前，首先将各种所需试剂加入到试剂瓶中。A瓶：5 mL无水正己烷；B瓶：10 mg TEABC溶解于1 mL无水乙腈中；C瓶：10 mg N-boc FLT前体溶解于0.6 mL无水乙腈中；D瓶：1 mL 1N HCl溶液；E瓶：1 mL 1N NaOH溶液；F瓶：5 mL H2O；G瓶：5 ml H2O；H瓶：10 mL 2%乙醇溶液；I瓶：10 mL 10%乙醇溶液。Sep-Pak QMA柱先用10mL 5%NaHCO3溶液清洗，再用10 mL水洗；Sep-Pak C18柱：先用10 mL乙醇清洗，再用10 mL H2O洗；Sep-Pak IC-H与Sep-Pak Al2O3柱：各用10 mL H2O清洗。

1.418F-FLT合成方法

国产氟多功能合成模块合成18F-FLT的合成线路见示意图1，合成流程见示意图2。18F-离子被QMA捕获后，无水正己烷清洗QMA，再将18F-洗脱至反应管，以3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧-3’-O-(4-硝基苯磺酰基-β-1)-苏戊呋喃糖]胸腺嘧啶脱氧核苷(N-BOCFLT)为前体，乙腈为溶剂，105℃下反应5 min，经酸水解，碱中和两步后，反应液最后通过Sep-Pak小柱分离纯化，再经无菌滤膜得到18F-FLT注射液。

图2 国产18F多功能合成模块合成示意图

2 实验方法

2.118F-FLT自动化合成步骤

①18F-由180(p,n)18F反应制备，传输并被QMA捕获；②用5 mL无水正己烷清洗QMA，液体经V10转移至废液瓶，100℃干燥反应管1；③将B瓶中的洗脱液转移至A瓶，淋洗QMA将18F-洗脱至反应管1，100℃蒸发除去乙腈至干；④加入C瓶前体，105℃下密闭反应5 min，其间两次短暂打开V9与V3，将管线中的液体吹回反应瓶；⑤加入D瓶中的HCL溶液，在90℃下水解反应5 min；⑥冷却反应管，加入E瓶中的NaOH溶液进行中和反应；⑦反应液经反应管2，Sep-Pak IC-H，Sep-Pak Al2O3柱转移至中转瓶，再由中转瓶通过Sep-Pak C18柱转移至废液瓶：⑧将G瓶中的5 mL H2O加入到反应管2中，并重复步骤⑦；⑨将H瓶中的10 mL 2%乙醇溶液加入到中转瓶，并通过Sep-Pak C18柱转移至废液瓶；⑩I瓶中的10 mL 10%乙醇溶液经Sep-Pak C18柱将产品通过无菌滤膜转移至产品瓶，即获得无色、透明的18F-FLT注射液。

2.218F-FLT的质量控制

①HPLC测定：Alltime C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙醇-水，体积比为8∶92；流速0.8 mL/min，流动相用放射性检测仪以267 nm UV检测。②TLC测定：将产品点样于硅胶板上，以95%的乙腈溶液为展开剂展开。③18F-FLT的稳定性测定：采用HPLC分析法，分别于第2、4、6 h分析产品的放化纯。

3 结果

本文通过对反应除水干燥过程与纯化处理两个部分的优化，改进了18F-FLT的自动化合成方法。该方法合成18F-FLT的总时间＜30 min，放射化学产率为10%～15%（未衰减校正n=3），放射化学纯度与化学纯度均＞95%（图3），TLC检测Rf≈0.7（图4），室温放置6 h，未见18F-FLT分解，能满足常规临床需要。我们在选用国产18F多功能模块的前提下，使用目前生产效率较高的N-Boc FLT为前体进行研究。

图3 18F-FLT纯化后的HPLC分析图

图4 18F-FLT纯化后的TLC分析图

3.118F-洗脱过程影响因素探讨

从目前18F-FLT的合成方法来看，使用的洗脱剂主要为相转移催化剂K222与K2CO3的乙腈水溶液，个别使用季铵盐的乙腈水溶液，但采用此种溶剂进行除水干燥时，所用时间＞12 min，并且高温除水时间越久，18F-损失越多，再考虑到18F-的半衰期较短（仅为109.7 min），因此本研究采用无水甲醇与无水正己烷/乙腈两种体系冲洗与淋洗QMA。结果显示，当冲洗液与淋洗液均以无水甲醇为溶剂时，18F-洗脱效率仅为50%；采用无水正己烷冲洗QMA，再用含相转移催化剂的乙腈淋洗QMA时，18F-洗脱效率约为90%。首次冲洗QMA时，有机溶剂的量应不少于5 mL，将QMA上的水充分除尽。由于国产18F多功能模块不能将用于除水的有机溶剂直接转移至废液瓶，而是通过反应管1转出，考虑到18F-FLT的合成对溶剂中的含水量要求较高，所以我们在将18F-洗脱至反应管后仍将乙腈蒸干，避免因管线里水导致反应失败。

该方法主要优点如下：①除水干燥时间＜5min；②使用季铵盐（TEABC）代替毒性较大的K222。

3.2 柱纯化条件的优化

由于反应中存在过量的前体以及大量的副产物，虽然常规的半制备HPLC纯化法能较为容易的将这些杂质除去，但耗时长（15～30 min）、产品吸附多，因此使用几种不同的Sep-Pak小柱来纯化（耗时3～5 min，吸附少），是目前研究的主要方向。我们首先采用文富华[11]等的方法来进行产品纯化，结果显示，18F-不能被完全除尽，并且张锦明[12]等对该实验的研究发现18F-FLT的化学纯度并不令人满意。在本研究中，我们采用低浓度的乙醇溶液进行产品纯化，首先固定反应的TEABC为10 mg，N-Boc FLT前体10 mg，105℃密闭亲核5 min，待反应完成后转移至Sep-Pak小柱进行纯化。

由于模块在使用过程中用到两根反应管，产品附着较多，所以我们首先用5 mL水将反应管中附着的产品转移至三根小柱上，随后我们分别考查了5 mL、10 mL与15 mL的2%的乙醇溶液对Sep-Pak C18柱的清洗效果，结果发现当洗脱剂为5 mL时，终产品中的放化纯为90%，化学纯为85%，而洗脱剂为10 mL与15 mL时，终产品18F-FLT的放化纯与化学纯均大于95%。最终我们确定采用10 mL 2%的乙醇溶液冲洗Sep-Pak C18小柱，再用10%的乙醇溶液将产品淋洗进无菌真空瓶，即得18F-FLT注射液。

4 结论

利用国产18F多功能合成模块，我们发展了一种快速，简单可靠的18F-FLT制备方法，在研究中，我们采用无水正己烷来清洗QMA并且使用Sep-Pak小柱对产品进行分离纯化，和其它18F-FLT合成工艺相比，该方法缩短了反应时间，简化了反应过程，并获得了高放化纯与化学纯的18F-FLT注射液，该法易于实现18F-FLT自动化合成，目前我们正在努力提高18F-的洗脱效率以及开展进一步的质量控制研究，以便该法生产的18F-FLT在临床中推广应用。

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（2015-03-31收稿）

Rapid automated synthesis of 3’-deoxy-3’-[18F]fluorothymidine based on a domestic18F multi-function module

Liu Nan，Wan Qiang，Chen Yue
Departmentof Nuclear Medicine，the First Affiliated Hospitalof Sichuan Medical University

Objective：To providea simple rapid automated method of synthesis of18F-FLT by using domestic18F multi-function module for clinical need.Methods:First,Sep-Pak QMA cartridge was rinsed with anhydrous methanol,then the trapped18F-was eluted into the reaction vessel with tetraethylammonium bicarbonate as phase transfer catalyst.With 3-N-t-butoxycarbonyl-1-[5’-O-(4,4’-dimethoxytriphenylmeth-yl)-2’-deoxy-3’-O-(4-nitrobenzenesulfonyl)-β-D-threopentofuranosy]thymine as the precursor molecule,the18F-FLT injection was eventually prepared by nucleophilic reaction,hydrolysis,neutralization,and purification withSep-Pak cartridge. Results：The automated synthesis of18F-FLT was successfully completed with the total synthesis time of about 25～30 min.the uncorrected yield was between 10%and 15%,and both the radiochemical purity and chemical purity were greater than 95%.The retention time of18F-FLT and19F-FLT on the analytical HPLC was 14.3 min and the Rf value was about 0.7 according to TLC analysis.Conclusion：A reliable,simple and efficient method of preparation of18F-FLT has been developed,which provides an efficient and rapid drying method for18F-.and through Sep-Pak cartridge purification to obtain18F-FKT injection of high radioch evical purity and chemical purity.

18F-FLT;Sep-Pak purification;Automated synthesis;Radiosynthesis

R817

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.007

*四川省科技厅-泸州市政府-泸州医学院联合科研专项基金项目（编号：14ZC0062）

刘楠（1983-），男，讲师，博士

陈跃（1968-），男，教授，硕士，E-mail：chenyue5523@126.com