刘 宾,李媛媛,王晓明,曹凤波,霍贵成,杨丽杰

(东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

牛初乳生长因子粗提物对CaCO-2细胞增殖和迁移的影响

刘 宾,李媛媛,王晓明,曹凤波,霍贵成,杨丽杰*

(东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

本文探讨牛初乳生长因子粗提物对CaCO-2细胞生长和迁移的作用,为治疗人类胃肠炎症提供一种安全可靠的方法。给予CaCO-2细胞一定剂量的牛初乳生长因子粗提物,通过MTT法,分别测定12、24、36h细胞的增殖率;用BCA试剂测定CaCO-2总蛋白质含量;用划线法测定细胞的迁移能力。结果表明:与对照组相比,细胞增殖率与牛初乳生长因子粗体物有剂量依懒性。培养12h时,100ng/mL牛初乳生长因子即能显著刺激细胞增殖,达到16.3%(p<0.05),1μg/mL时,有最大的增殖率20.6%;培养24,36h时,1μg/mL牛初乳生长因子粗提物对细胞有最大增殖率,分别达到30.8%和40.0%,但是此时显著低于10%胎牛血清对细胞的增殖率;细胞蛋白质和迁移速度也与牛初乳生长因子粗提物浓度呈现剂量依懒性关系,在10μg/mL时,达到最大含量和迁移速度;本研究证实牛初乳生长因子粗提物能显著促进细胞增殖,蛋白质含量增加和细胞迁移速度。

初乳,生长因子,增殖,迁移

牛初乳是指奶牛分娩后7d内特别是3d内所分泌的乳汁。初乳中不仅含有丰富的营养物质以及免疫球蛋白,还含有大量的生长因子,特别是泌乳后2d内[1]。随着泌乳时间延长,3～4d后初乳中的生长因子水平已经趋近于常乳。

牛初乳是自然界中唯一含有两类主要生长因子(类胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ,Ⅱ)和转化生长因子(TGF-β1,β2))的天然产物[2],而且IGF-Ⅰ和TGF-β2也是初乳中含量最高的两种生长因子,EGF只在分泌初期含量较多[3]。初乳还含有其他生长因子,如血小板生长因子(PDGF)、上皮生长因子(EGF)、成纤维生长因子(FGF)等。它们主要刺激表皮、上皮和胚胎细胞的增殖,抑制胃酸分泌,促进伤口愈合和骨吸收,在胚胎发生、组织修复、骨和结缔组织形成以及免疫控制中起重要作用[4]。IGF-Ⅰ与胃肠粘膜细胞酪氨酸激酶受体结合,使肠黏膜细胞生长和增殖,肠绒毛高度增加,促进小肠发育[5]。另外,研究发现IGF-I除能促进肠细胞生长外,还能刺激肠道组织中IgA的mRNA表达水平的提高,以维持肠道黏膜液层的功能[6]。表皮生长因子能够刺激表皮、上皮和胚胎细胞增殖,且无种属特异性,还能促进细胞内DNA、RNA、蛋白质、鸟苷酸脱氧核糖的合成以及细胞外大分子的合成。在小肠和结肠修复时,EGF能减少隐窝分裂,增加其增殖[7]。有研究证实从乳清中去除β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白,剩余成分比胎牛血清有更强的促细胞生长作用,对许多细胞系有增殖作用,这表明除常规营养成分外,促细胞生长作用归于其中的生长因子。但是Belford U[8-9]等研究发现TGF-β2能够抑制上皮细胞的分裂,由于其在初乳和初乳乳清中还有很高浓度的IGF-Ⅰ,Ⅱ及其结合蛋白,而且牛初乳中还含有其他促进细胞增殖的生长因子EGF,PDGF,FGF-2及含有结合蛋白[10-12],提取的促有丝分裂提取物仍有很强促细胞增殖的效果。

现代生活节奏的加快,饮食不规律,胃肠病发生率越来越高,日常生活中人们几乎都会不同程度地发生急性或慢性胃肠病。数据显示我国有近30%的人患有各种胃炎,目前全国胃病患者的总人数粗略估计就有近4亿人,而且其中40%病情严重。乳源生长因子预防和治疗这些疾患显现出巨大的潜能,不仅来源广泛,而且安全有效。而且应用乳源生长因子代替胎牛血清,用于细胞工程也具有很大的潜力。单一生长因子对伤口愈合,胃肠炎治疗,细胞增殖都已经被验证。Simat Siti Fatimah[13]等证实表皮生长因子(EGF)能调节人羊膜上皮细胞循环周期,显著增加S-和G2/M细胞比例,促进细胞增殖,Igor Sukhotnik[14]等证实转化生长因子-α(TGF-α)能够修复和改善由氨甲喋呤引起的大鼠肠损伤,显著增加空肠和回肠肠、黏膜的重量,DNA、蛋白质的含量以及绒毛的长度,吕剑光[15]等研究牛初乳胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对氨甲喋呤引起大鼠肠损伤的影响,证实IGF-Ⅰ能够明显修复大鼠肠道损伤,降低因肠道损伤而大量产生的二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的含量。几种生长因子协同对上皮细胞增殖和迁移的作用仍然是未知的。本实验主要是以CaCO-2为模型,研究从牛初乳中提取的生长因子提取物对CaCO-2细胞增殖和迁移方面的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛初乳 由黑龙江完达山松北牧场提供;凝乳酶 由丹尼斯特(中国)有限公司提供;胰蛋白酶 购自北京索莱宝科技有限公司;高糖DMEM培养液 购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;CaCO-2 由东北农业大学乳品重点实验室提供;胎牛血清(FBS) 购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、细胞裂解液 购自青岛海泰生物技术有限公司。

JC10-NN3MT-100乳成分分析仪 北京北信科仪分析仪器有限公司;低速离心机LD4-2 北京医用离心机;300ku陶瓷膜超滤仪 北京华创源泉环境技术有限公司;100、30ku超滤离心管 上海艾研生物科技有限公司;HF90型CO2培养箱 香港力康发展有限公司;洁净工作台VD-1320 北京东联哈尔仪器制造有限公司;AE-30型倒置生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司;6孔板、96孔板 北京欣源佳和生物科技有限公司;Model 680型酶标仪 美国Beckman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛乳基本成分的测定 将分娩后2d内的牛初乳和常乳置于水浴锅中恒温至25℃,上机测定奶样成分。

1.2.2 牛初乳中生长因子粗提物的提取 将健康母牛分娩后2d内的牛初乳,过滤除杂,离心脱脂(7000r/min,15min,4℃),小心地取出上层脂肪,将脱脂乳控温至37℃,边搅拌边缓慢加入凝乳酶(效价1万,添加量0.1%),37℃保温凝乳,凝乳后将乳块破碎,在8000r/min,4℃下离心20min,收集乳清[16]。用陶瓷膜超滤仪除去乳清中大于300ku的大分子物质,然后将滤出的清液分别依次用100、30ku的超滤离心管离心(4000×g,15min,4℃),收集最后的清液。

将所得的提取液进行脱盐处理,采用3500u的透析袋,吸水剂为聚乙烯吡咯,将所得产物冷冻干燥后贮存,即为生长因子粗提物。

1.2.3 MTT法测定初乳生长因子对CaCO-2促增殖作用 将处于对数生长期的CaCO-2细胞,用胰蛋白酶消化,含10%胎牛血清的DMEM培养基配制成单细胞悬液调整细胞密度约为1×105/mL,以每孔100μL加入96孔培养板。将牛初乳生长因子提取物配制成1mg/mL,作为母液,用无血清的DMEM配制成100、10、1μg/mL、100、10、1ng/mL梯度浓度的实验溶液。培养24h后,吸取培养液,加入不同浓度的实验溶液100μL,空白对照组加无血清培养基,含10% FBS的培养基为阳性对照组。细胞在37℃,5%二氧化碳状态下分别培养24、36和48h后,每孔加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(简称MTT)20μL。继续37℃孵育4h后,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL,震荡10min。于酶联免疫检测仪490nm波长检测OD值,并计算增殖率。初乳生长因子对CaCO-2细胞的促生长作用以CaCO-2细胞增殖率来衡量,计算公式:

细胞增殖率(%)=(A实验组-A对照组)/A对照组×100

1.2.4 牛初乳生长因子粗提物对CaCO-2蛋白质含量的影响 用含10% FBS的高糖DMEM培养液将密度为5×104个/mL细胞接种于6孔板中,待细胞汇合程度达到60%时,换用无血清的DMEM培养基继续培养24h,使其同步化。弃去原培养液,添加100、10、1μg/mL、100、10ng/mL的生长因子粗提取物,空白用无血清DMEM细胞组做对照。在细胞培养箱中继续培养24h。用4℃的PBS冲洗3遍,每瓶加入0.5mL含0.1%的Trition细胞裂解液,置于-20℃和4℃条件下,反复冻融30min。将各组蛋白溶液转移到96孔板中,每组20μL,加入BCA(bicinchonininc acid)法蛋白测定液100μL,震荡10min,测定570nm条件下的OD值。

1.2.5 牛初乳生长因子对CaCO-2迁移的影响 用含10%胎牛血清的DMEM培养液将CaCO-2细胞接种到24孔板中,每孔1mL,待细胞铺满底层板时,换用无血清的培养基培养24h,使其同步化,用严格灭菌的枪头在底部划出一条直线,并做好标记,用PBS清洗3次,分别加入100、10、1μg/mL、100、10、1ng/mL生长因子粗提物。分别记录0、12、24、36h的图像,用Image plus+软件计算迁移距离,迁移距离=划痕0h后划痕宽度-划痕处理后划痕宽度。

1.2.6 数据处理 数据以Means±SD表示,统计学分析采用SPSS19.0进行单因素方差分析。以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 牛初乳中的基本成分

牛初乳中与常乳中的营养成分有明显的区别(见表1),初乳中的脂肪和蛋白质含量明显高于常乳,灰分含量略微高于常乳。

表1 牛初乳基本成分的测定

2.2 牛初乳生长因子粗提物对CaCO-2细胞生长的影响

在培养12h时,和对照组相比(见表2),牛初乳生长因子粗提物在1ng/mL～1μg/mL的浓度范围内,CaCO-2细胞的增殖呈现剂量依赖性,并且在1μg/mL时,对细胞具有最大的促生长作用,与含10%胎牛血清高糖DMEM具有相似的增殖率。当浓度再次增大时,增殖率反而略有下降。

在培养24h时,与对照组相比(见表3),牛初乳生长因子在1ng/mL～1μg/mL的浓度范围内,仍然与CaCO-2细胞具有剂量依赖性关系,在1μg/mL时,具有最大增殖率,要比对照组高出30%,但是要显著低于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基对细胞促生长作用。随着浓度增大,细胞增殖速率反而会略有降低。

表2 牛初乳生长因子与CaCO-2细胞的剂量效应(12h)

注:数据表示为平均值±标准差(n=3)。同一列数据中字母相同则表示差异不显著(p>0.05),不同则表示差异显著(p<0.05),表3、表4同。

表3 牛初乳生长因子与CaCO-2细胞的剂量效应(24h)

与对照组相比(见表4),用含牛初乳生长因子粗提物的培养基培养CaCO-2细胞,36h后,牛初乳生长因子在1ng/mL～1μg/mL作用范围内,呈现剂量依赖性(p<0.05),1ng/mL的牛初乳生长因子粗提物能显著促进CaCO-2细胞生长。在1μg/mL时,具有最大促生长作用,但是增殖率要显著低于含10%FBS的高糖DMEM对细胞的促生长作用。

表4 牛初乳生长因子与CaCO-2细胞的剂量效应(36h)

2.3 牛初乳生长因子粗提物对CaCO-2总蛋白含量的影响

细胞同步化培养后,经含不同浓度牛初乳生长因子粗提物的DMEM培养基培养CaCO-2细胞,发现不同浓度牛初乳生长因子粗提物都能显著促进CaCO-2细胞总蛋白质含量的增加(见图1),且随着浓度的增加,细胞总蛋白质含量呈现剂量依赖性,且10ng/mL牛初乳生长因子粗提物能显著增加细胞蛋白含量(p<0.05)。10μg/mL牛初乳生长因子粗提物较大幅度提高细胞蛋白质浓度,但是低于用含10%FBS的高糖DMEM对细胞总蛋白的作用。

图1 不同浓度生长因子粗提取对CaCO-2总蛋白质含量的影响Fig.1 Effect of different concentrations of growth factors extract on CaCO-2 total protein content注:与对照组相比,*p<0.05;**p<0.01。

2.4 牛初乳生长因子对CaCO-2细胞迁移的影响

与对照组细胞相比(见图2、图3),不同浓度牛初乳生长因子都能显著促进细胞迁移(p<0.05)。浓度增大,迁移速度明显加快,在10μg/mL条件下,有最大的迁移速度。在浓度大于10ng/mL时,单位时间内,迁移的速度显著快于对照组。在×40倍光镜下观察,发现含有10μg/mL牛初乳生长因子粗提物组细胞的迁移速度要明显快于100ng/mL组,更显著快于对照组(p<0.01)。

图2 不同浓度牛初乳生长因子对CaCO-2细胞迁移的影响Fig.2 Effect of different concentrations of colostrum growth factor on CaCO-2 cells migration

图3 不同浓度生长因子粗提物对细胞迁移的影响Fig. 3 Effect of different concentrations of colostrum growth factor on CaCO-2 cells migration

2.5 讨论

目前,国内关于牛初乳生长因子粗体物对上皮细胞增殖和迁移的研究并不多,BELFORD[8]等用阳离子交换色谱层析技术从乳清中提取富含促有丝分裂的成分,其中里面就含有大量的生长因子活性成分,作用于多种成纤细胞和上皮细胞。其研究发现乳中促有丝分裂物能促进中胚层细胞增殖,但是能抑制上皮细胞生长。但是本研究却发现牛初乳生长因子粗体物能促进上皮细胞CaCO-2生长。在24h时,其促细胞增殖率和含10%胎牛血清培养基促细胞增殖率是基本上相同的。然而,继续培养细胞36,48h时,牛初乳生长因子粗提物仍能促进上皮细胞CaCO-2的生长,但是其对细胞的增殖率已经显著低于含10%胎牛血清培养基对细胞增殖率。可以看出牛初乳生长因子粗提物能够在短时间内促进上皮细胞CaCO-2生长。Timothy E. Rayner[17]等认为尽管牛初乳促有丝分裂提取物中含有抑制上皮细胞系生长的TGF-β2,但是仍然含有很高浓度的IGF-Ⅰ,Ⅱ及其结合蛋白,EGF,PDGF,FGF-1,2,促进上皮细胞的生长。

胰岛素样生长因子-Ⅰ受体具有潜在有丝分裂原作用,正常水平下其与胰岛素样生长因子-Ⅰ结合后可致β亚单位的磷酸化激活酪氨酸激酶活性细胞信号传导路径,起到促进细胞有丝分裂增殖和转化的作用[18]。表皮生长因子及其受体启动的最重要的信号转导途径是Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK,与细胞的增殖转化和分化相关[19]。CaCO-2细胞在含1μg/mL牛初乳生长因子粗提物时具有最大生长速率,而随着浓度增大,增殖率反而有所降低,可能是由于作用于细胞上的生长因子受体已经趋于饱和或者是部分作用。因为转化生长因子能够抑制上皮细胞增殖,多种其他生长因子促进细胞增殖,使得各种生长因子相互协调,达到相对平衡所致。

李彩虹[20]等研究发现表皮生长因子能够促进人羊膜间充质干细胞的迁移,并证明了迁移与EGFR-PI3K信号通路有关。Timothy E. Rayner[10]等证实促有丝分裂乳清生长因子能加速大鼠伤口愈合速度。这与本文的研究结果是相符的。细胞迁移速度与生长因子粗提物浓度具有剂量依懒性,且作用时间越长,迁移效果越明显。

虽然与单一生长因子的纳克级相比,乳源生长因子粗提物作用范围在微克级,但是乳源生长因子作为一种治愈肠道黏膜损伤以及替代血清应用细胞工程具有极大的潜力。

3 结论

牛初乳中含有大量生长因子,作为一种来源广泛,安全的原料,提取里面的生长因子治疗肠胃炎症疾病具有很大前景。本研究通过将提取的牛初乳生长因子粗提物作用于上皮细胞CaCO-2。发现牛初乳生长因子粗提取能显著促进CaCO-2细胞的增殖和增加细胞总蛋白质含量,能够短期替代胎牛血清,而且能显著加快细胞迁移速度,对于治疗胃肠粘膜疾病具有积极作用。

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Effect of colostrum growth factors extracts on proliferation and migration of CaCO-2 cells

LIU Bin,LI Yuan-yuan,WANG Xiao-ming,CAO Feng-bo,HUO Gui-cheng,YANG Li-jie*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China)

In this study,the effect of colostrum growth factors extracts on the proliferation and migration of CaCO-2 cells was investigated,which provided a safe and reliable way for the treatment of human gastrointestinal inflammation. Proliferation rate of CaCO-2 cells were determined by MTT assay at 12,24,36h respectively,CaCO-2 total protein content were determinated by BCA reagent. The migration of CaCO-2 cells were determined by scratch assay after given a dose of colostrum growth factors extracts. Results indicated that CaCO-2 cells were related with colostrum growth factors extracts in a way of dose-dependent manner,compared with the control group. Colostrum growth factors with 100ng/mL could stimulated dramatically the proliferation of CaCO-2 cells at culturing 12h,by 16.3%(p<0.05). When the concentration was 1μg/mL,the cells had the maximum proliferation rate by 20.6%. Colostrum growth factors extracts with 1μg/mL could stimulate cells with maximum proliferation at culturing 24,36h,increased by 30.8% and 40.0%,respectively,but significantly lower than the proliferation rate by the medium containing 10% fetal bovine serum. Cells protein content and migration speed also had related with colostrum growth factors extracts in a way of dose-dependent manner. There were the maximum protein content and migration speed with 10μg/mL. These results demonstrated that colostrum growth factors extracts significantly accelerated cells proliferation rate,increased cell protein content and migration speed.

colostrum;growth factors;proliferation;migration

2014-06-25

刘宾(1989-),男,硕士,研究方向：乳品科学。

*通讯作者:杨丽杰(1956-),女,硕士，教授,研究方向：乳品安全与监控。

黑龙江省教育厅面上项目基金资助。

TS252.1

A

1002-0306(2015)07-0354-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.066