赵丽姣，于会艳，金 莹，晁 宁，郝 莹，林悄然，顾卫红，秦 斌*

（1北京大学第五临床医学院（北京医院）神经内科，北京 100730；2北京中日友好医院神经内科，北京 100029；3北京房山区良乡医院神经内科，北京 100240）

高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinimia，HHcy）与帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的关系近来备受关注，特别是长期应用左旋多巴（L-dopa）治疗的PD患者，它不仅可以导致同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）升高，而且HHcy还可能与PD运动并发症（剂末现象、开关现象、异动症），非运动症状如焦虑和抑郁、认知功能减退的发生密切相关[1−4]。Hcy是甲硫氨酸代谢的中间产物，导致HHcy血症的原因通常是体内维生素（Vitamin，Vit）B6、Vit B12和叶酸的缺乏或具有N5，N10亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate，MTHFR）和胱硫醚β合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）基因突变[2,3]。L-dopa是治疗PD的主要药物，一般需要长期服用、且随病情加重而逐渐加量，L-dopa在脑内和体内降解需要儿茶酚胺−O−甲基转移酶（catechol-O-methyl-transferase，COMT）的参与，如果COMT酶基因发生突变也会影响Hcy的代谢[2,3]。那么HHcy与PD和L-dopa治疗之间的关系，以及与Vit B12、叶酸和MTHFR、COMT的基因突变关系如何？目前国内相关研究报道不多，为此本文对PD患者的血浆Hcy水平，Vit B12、叶酸浓度和MTHFR基因C677T多态性及COMT基因多态性进行了综合分析，并比较HHcy与PD药物治疗及并发症发生率的相关性。现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

依据英国脑库PD诊断标准[3,5]，从2011年5月至2013年3月来北京大学第五临床医院神经内科住院及门诊就诊患者中入选，一共收集PD组161例，其中男性88例，女性73例，年龄（64.36±11.06）岁，病程范围：0.5～22（6.3±5.4）年。入组前Hoehn-Yahr临床分级评定：1～1.5级66例（41.0%），2～2.5级46例（28.6%），3级33例（20.5%），4级12例（7.4%），5级4例（2.5%）。所有患者被分成3组：未接受L-dopa治疗组76例，接受L-dopa治疗组85例，剂量（486.9±240.5）mg/d，后者再分为接受L-dopa治疗＜6年组63例和≥6年组22例，对服用L-dopa治疗者，询问和统计运动并发症如开关现象、剂末现象、晨僵少动和异动症的发生率（患者日记）。因PD常常合并焦虑、抑郁和认知功能减退等症状，入组后常规进行焦虑、抑郁和认知功能量表初步筛查，依据痴呆的诊断标准[6]，汉密尔顿焦虑量表（Hamilton Anxiety Scale，HAMA），汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Scale，HAMD）17项进行评定筛查。全部入选患者均晨起空腹抽取静脉血测定血浆叶酸、Vit B12和Hcy浓度。

另外，在来院进行常规健康体检者中，选出80例作为正常对照组，其中男性57例，女性23例，年龄46～80（58.2±8.6）岁，全部入选者均晨起空腹抽取静脉血测定血浆叶酸、Vit B12和Hcy浓度。考虑MTHFR基因和COMT基因多态性分析对照组例数偏少，我们随后又增加160例作为正常对照组，这样正常对照组共240例，其中男141例，女99例，年龄（63.96±9.79）岁，进行MTHFR基因和COMT基因多态性分析。

1.2 方法

血浆叶酸浓度的测定采用阴离子捕获技术微粒子酶联免疫分析法。血浆Vit B12浓度测定采用微粒子酶联免疫分析法。血浆Hcy浓度测定采用高效液相色谱法，以对照组血浆总Hcy均值±2S为正常参考范围，超过其上限（15µmol/L）为高同型半胱氨酸血症[7,8]。

1.3 MTHFR C677T基因和COMT基因多态性分型和测序验证

使用Oligo6.0软件，依据dbSNP数据库中MTHFR C677T rs1801133（C/T）和rs1801131（A/C）和COMT基因多态性rs4818（C/G）、rs4680（G/A）和rs6269（A/G）侧翼序列设计上下游引物，应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）高分辨熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术，依据溶解曲线检测突变（具体方法参见参考文献[8]）。每个基因型随机抽取5%的样本进行重复测序验证，然后所有样本送天一辉远公司测序。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差描述，计数资料用百分率（%）描述。计量资料两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用one-way ANOVA；计数资料的组间率的比较采用Pearson卡方检验，计算比值比（odds ratio，OR）及95%可信区间（confidence interval，CI）。基因分型数据在对照组中经哈代−温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）拟合优度检验评价多态性的群体代表性。采用四格表卡方检验，OR值表示风险比值。logistic多因素回归分析各因素对Hcy的影响作用。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PD组与对照组Hcy、叶酸、Vit B12浓度比较

161例PD患者血浆Hcy浓度（17.65±9.36）µmol/L，与80例正常对照组相比[（10.12±3.20）µmol/L]明显升高（t＝6.989，P＜0.01），表明PD患者血浆Hcy水平显著高于正常对照组。叶酸和Vit B12浓度两组相比，差异无统计学意义（P＞0.05；表1）。

2.2 单因素分析各因素对Hcy的影响作用

根据PD患者临床资料和血浆Hcy水平影响因素，将患者年龄（＜60岁和≥60岁）、性别、是否L-dopa治疗、治疗时间（＜6年和≥6年）、叶酸浓度（正常和降低）、Vit B12浓度（正常和降低）分为6个亚组，采用单因素分析6个因素比较组间Hcy水平（见参考文献[6]），结果表明L-dopa治疗对血浆Hcy升高有影响，接受L-dopa治疗的患者中Hcy水平明显高于未接受L-dopa治疗的患者[（20.04±10.34）vs（16.29±8.40），t＝2.343，P＜0.05]；而其他因素包括性别、年龄、是否接受L-dopa治疗、治疗时间、叶酸和Vit B12浓度等对Hcy的升高无明显影响（P＞0.05）。统计结果表明L-dopa治疗是PD患者Hcy升高的独立影响因素之一。

2.3 L-dopa治疗与未治疗组患者血浆HHcy血症成因分析

161例PD患者中有77例伴有HHcy血症，导致PD患者HHcy血症原因分析结果得出3组HHcy血症主要以正常叶酸和Vit B12浓度为主，约占＞84%（65/77），这间接提示可能与MTHFR和CBS基因突变有关，而与叶酸和Vit B12缺乏关系不显著（表2）。

2.4 PD组与对照组MTHFR基因和COMT基因多态性的比较

MTHFR和COMT基因多态性分型及测序验证结果提示，这两种基因的多态性分布在PD组和对照组均无显著性差异（表3）。对于每个基因型随机抽取5%的样本进行重复测序验证，一致性为100%。MTHFR和COMT基因多态性分布经Hardy-Weinberg平衡检验，P＞0.05，具有人群代表性。对PD组按照Hcy水平进一步分层分析，＞15µmol/L即为HHcy组，＜15µmol/L为Hcy正常组，结果表明：MTHFR基因型及等位基因在HHcy组和Hcy正常组的频率分布差异有统计学意义（P＜0.05；见参考文献[8]），提示PD伴HHcy者与MTHFR基因C677T多态性（rs1801133）关系密切。而PD组与正常对照组中COMT基因多态性分布差异无统计学意义，提示PD伴HHcy者与COMT基因多态性关系不密切。

表1 PD组与对照组Hcy、叶酸、Vit B12浓度比较Table1 The comparison of the concentration of Hcy, folic acid and Vit B12 between PD and control groups (±s )

表1 PD组与对照组Hcy、叶酸、Vit B12浓度比较Table1 The comparison of the concentration of Hcy, folic acid and Vit B12 between PD and control groups (±s )

Hcy：homocysteine; Vit B12：vitamin B12; PD：Parkinson’s disease

Group n Hcy (µmol/L) Folic acid (µg/L) Vit B12 (µg/L)PD 161 17.65±9.36 8.83±3.92 547.01±391.23 Control 080 10.12±3.20 8.24±3.15 579.34±341.62 t value 6.989 1.193 -0.642 P value ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

表2 L-dopa治疗和未治疗组患者血浆HHcy血症成因分析Table2 The causes of HHcy in PD patients with and without treatment of L-dopa (n)

表3 PD组与对照组MTHFR基因和COMT基因多态性的比较Table3 The comparison of genetic polymorphisms of MTHFR and COMT in both PD and control groups

2.5 HHcy与L-dopa治疗后并发症发生率间的关系

在77例伴有HHcy的PD患者中，剔除未治疗组22例外，余55例中有运动波动症者35例，占63.6%，有异动症者3例，占5.5%，有焦虑和抑郁30例，占54.5%，有痴呆者12例，占21.8%。提示HHcy血症与L-dopa治疗后出现运动并发症，焦虑、抑郁和帕金森痴呆（Parkinson’s disease dementia，PDD）关系密切。另外，PD和PDD两组患者血浆Hcy平均浓度比较结果表明，PDD组[（19.76±10.85）µmol/L；n＝12]明显高于PD组（16.95±8.79µmol/L，n＝149）（P＜0.01），表明PDD与HHcy血症关系较密切。

3 讨 论

本研究结果表明，161例PD患者平均血浆Hcy浓度明显高于正常对照组，说明PD患者常伴有HHcy血症。161例PD患者中63例接受L-dopa治疗＜6年，22例接受L-dopa治疗≥6年，其平均血浆Hcy浓度分别是（16.43±8.04）µmol/L和（19.91±9.73）µmol/L，提示L-dopa治疗的PD患者可伴有HHcy血症，这与国内外文献报道L-dopa治疗可导致Hcy升高结论相同[2−4]。进一步通过对PD患者血浆Hcy水平影响单因素分析发现，纳入分析的6个因素：性别、年龄、是否接受L-dopa治疗、治疗时间、叶酸和Vit B12浓度中仅有L-dopa治疗是PD患者Hcy升高的独立影响因素之一[7]。

一般导致HHcy血症的原因主要是体内Vit B6、Vit B12和叶酸的缺乏或具有MTHFR和CBS基因的突变，其中膳食中摄取Vit B12和叶酸不足及MTHFR基因突变是产生血浆Hcy升高的三大直接因素[1,2]。对于PD患者，L-dopa未治疗和治疗的HHcy血症成因分析结果发现，导致Hcy升高的原因以正常血浆Vit B12和叶酸浓度者为主，三者均达＞84%，这间接提示Hcy升高可能与MTHFR和CBS基因突变有关，国外文献研究报道主要是MTHFR C677T纯合子突变可能是导致PD患者血浆HHcy血症的遗传决定簇[9,10]，这一结论同我们研究结果相同。

C677T多态性为MTHFR基因上第4个外显子上的一个重要错义突变，与CC野生型相比，TT纯合子型降低了70%酶的活性，而CT杂合型降低约40%[11]。本研究通过161例PD组MTHFR分层分析，Hcy浓度以15µmol/L为界值，MTHFR基因型及等位基因在HHcy组和Hcy正常组的频率分布差异有统计学意义（P＜0.05）（见参考文献[8]），提示PD伴HHcy者与MTHFR基因C677T多态性（rs1801133）关系密切[3,10,12,13]。

PD患者服用L-dopa药物治疗后可能产生HHcy血症，其机制是L-dopa体内甲基化，形成3−O−甲基多巴后则由COMT催化，以S−腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，反应产物S−腺苷高半胱氨酸在S−腺苷高半胱氨酸水解酶作用下快速转变为Hcy，使血浆Hcy水平升高[1,9,10]。本研究没有证实PD组和正常对照组COMT基因多态性有明显变异（P＞0.05），说明L-dopa药物治疗是导致PD患者HHcy血症的又一独立危险因素之一[1,9,10]。新近研究表明复方L-dopa制剂加用COMT抑制剂可降低Hcy水平，其机制是COMT抑制剂可降低L-dopa在外周的代谢，减少L-dopa被甲基化的产物[14]。

应用L-dopa治疗会导致Hcy升高，能否增加运动并发症（如剂末现象，开关现象和晨僵少动等）、异动症和痴呆的发生率呢？本研究表明161例PD患者中有77例伴高Hcy血症，剔除未治疗组22例外，余55例中有运动波动症者35例（63.6%），有异动症者3例（5.5%），有焦虑和抑郁30例（54.5%），有痴呆者12例（21.8%），从而推测应用L-dopa治疗不仅导致Hcy升高，而且还增加运动并发症、焦虑、抑郁和痴呆发生率，与国外文献报道结论相同[1−3]。本组病例异动症发生率较少，究其原因可能是因为国人应用L-dopa剂量少和入选病例H-Y分级4期和5期者少有关。Hcy升高与痴呆发生的密切关系已被证实，本组资料显示PDD组平均血浆Hcy浓度明显高于PD组，进一步证实PDD与HHcy血症密切相关，与国外文献报道结论相同[3,4]。

总之，PD与HHcy血症关系十分密切，导致HHcy血症的原因主要与L-dopa治疗有关，亦可能是PD疾病本身导致MTHFR基因突变所致。HHcy对PD患者的影响不可忽视，临床应定期监测Hcy水平变化，对判断疾病的进展，L-dopa治疗相关的并发症和痴呆发生率有一定的帮助，应该引起临床医师高度关注和重视。另外，为了延缓L-dopa治疗相关的并发症和HHcy血症的发生，我们提倡复方L-dopa制剂和COMT抑制剂联合应用治疗早期PD[15−17]。

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