吴剑平，张鑫，李丹妮，严凤，周悦榕，顾欣

（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

五种抗菌药物从猪、鸡饲料至有机肥中的药物残留迁移规律研究

吴剑平，张鑫，李丹妮，严凤，周悦榕，顾欣∗

（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

为研究抗菌药物从饲料向畜禽粪肥转移的残留迁移规律，将40头猪和200羽鸡分为饲喂组和空白对照组进行饲喂对照实验和粪便堆肥发酵实验，其中空白对照组使用普通全价饲料，饲喂组在饲料中加入盐酸金霉素50 mg／kg、磷酸泰乐菌素50 mg／kg、磺胺对甲氧嘧啶各50 mg／kg、恩诺沙星150 mg／kg、二甲氧苄啶10 mg／kg，每日及时对各组实验动物粪便进行采集，样品经提取和净化后使用液相色谱-串联质谱进行分析定量。所得结果表明，猪、鸡饲喂含多种抗生素饲料后粪便中可以检出抗菌药物原型，其可能进入有机肥料发酵制作的环节。参照猪、鸡粪便中排出抗菌药物含量峰值建立模型对发酵期间粪肥中抗菌药物含量进行采样测定，结果显示，恩诺沙星、泰乐菌素和二甲氧苄啶在堆肥过程中会由于温度升高和氧化作用发生降解，其半衰期在5周左右，到10周后其含量低于检测限；但金霉素和磺胺对甲氧嘧啶被少量降解，残留迁移风险较高。

抗菌药物；畜禽粪便；残留迁移规律；液相色谱-串联质谱法；堆肥发酵

Key words：antibiotics；manure of livestock and poultry；migration regularity of residue；LC-MS／MS；compost fermentation

抗菌药物一般是指具有杀菌或抑菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺及磺胺增效剂类、氟喹诺酮类等化学合成药物。从20世纪80年代初至今，我国畜牧业正逐渐向规模化、集约化方向发展。大规模、集约化、高密度的畜禽养殖对动物疫病防控提出了更高的要求，在此过程中抗菌药物正扮演着越来越重要的角色，其中四环素类、大环内酯类、磺胺类和氟喹诺酮类抗菌药物常被用作饲料添加剂以起到疾病防治和促进生长的作用，称之为抗菌生长促进剂［1-3］。然而，这同时也带来了滥用抗菌药物的现象，2012年11月肯德基的供应商山西粟海集团“速成鸡”事件被曝光，据报道在饲喂过程中涉及到11种药物，其中主要为抗菌促生长剂。据文献报道［4］，抗菌药物的滥用和具有广谱耐药性基因的“超级细菌”的产生有一定联系，另外土壤抗生素污染可对土壤微生态系统造成严重破坏，甚至影响土壤肥力和植物生长。而目前有研究表明通过有机肥堆肥熟化可以通过降解抗菌药物而降低其对土壤环境的风险［5-6］，因此当前研究多种抗菌药物从饲料到有机肥的残留迁移规律就有相当的必要性。

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器 超高效液相色谱串联质谱系统（Waters®UPLC-TQ MS，Masslynx®工作软件）；高速冷冻离心机（Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；电子天平（Mettler AE240，瑞士）；VisiprepTM-DL型固相萃取装置（Supelco，美国）；N-EVAP112氮吹仪（Orangaomation，美国）。

1.2 材料与试剂 二甲氧苄啶（99%，中国食品药品检定研究院）；恩诺沙星（99.8%，中国兽医药品监察所）；金霉素（92%，DrEhrenstofer GmbH）；磷酸泰乐菌素（98%，DrEhrenstofer GmbH）；磺胺对甲氧嘧啶（99%，DrEhrenstofer GmbH）；乙睛（Merk，色谱纯）；甲醇（Merk，色谱纯）；氨水、醋酸、氢氧化钠、硝酸镁、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸钠（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；Oasis®HLB固相萃取柱（3 mL／60mg，Waters）；McIlvaine-EDTA缓冲液（pH＝4.1，Sigma），去离子水（密理博公司Milli-Q，电阻率＞16 MΩ·cm）。

1.3 实验动物 100日龄体重80 kg左右健康本地品种肉猪40头；7～12周龄体重3 kg左右本地品种肉鸡200羽。

2 实验方法与结果

2.1 粪肥中多种抗菌药物提取和富集净化方法称取样品1 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，准确加入10 mL McIlvaine-EDTA（pH＝4.0）缓冲液，充分振荡10 min，离心10 min（8000 r／min），取出全部提取液。重复上述操作，合并两次上清液，充分混匀并准确吸取4.0 mL提取液，离心10 min（10000 r／min）待用。HLB固相萃取小柱依次用3 mL甲醇，3 mL水活化。取4 mL离心备用液过柱，依次用3 mL 5%甲醇溶液淋洗，3 mL甲醇洗脱。收集洗脱液于40℃水浴下用氮气吹至近干，用1.0 mL 0.1%甲酸甲醇溶液（85／15，V／V）溶解残渣，溶液过0.22 μm滤膜后上机测定。

2.2 样品中多种抗菌药物残留LC-MS／MS检测条件 色谱柱：Agilent SB C18 RRHD 1.8 μm 2.1 mm×100 mm；柱温：35℃；进样量：10 μL；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸溶液；流速：0.3 mL／min，优化的色谱梯度洗脱程序见表1。离子源：电喷雾正离子源；电离模式：正离模式（ESI+）；检测方式：多反应检测（MRM）；电离电压：3.5 kV；锥孔温度：500℃；脱溶剂气流：800 L／h；反吹气（氮气）：50 L／h；定性离子对、定量离子对及对应锥孔电压和碰撞能量见表2，5种抗生素混合标准品的MRM色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

表2 6种抗生素的定性、定量离子及锥孔电压、碰撞能量

图1 粪肥中5种抗生素10 ng／mL混合标准溶液的MRM色谱图

2.3 猪、鸡饲喂含抗菌药物饲料对照实验 将选取的40头100日龄本地肉猪分为两组分栏饲养，每组20头，其中A组为空白对照组，B组为饲喂实验组，具体饲喂情况见表3；将选取的200羽7～12周龄本地肉鸡分为两组分栏饲养，每组100羽，其中A组为空白对照组，B组为饲喂实验组，具体饲喂情况见表3。饲喂实验组动物连续饲喂含多种抗菌药物饲料4 d后换回空白饲料饲喂3 d。每日对棚舍中靠近中心的4处和靠近边角的4处随机位置的粪便进行8点采集，每份粪便样品约50 g，混匀后常温下晾干，棚舍在每日采样后进行清扫防止对第二天的粪便样品造成污染。

表3 分组饲喂实验表

2.4 猪、鸡饲喂含抗菌药物饲料后粪便中原型药物含量蓄积与消除实验结果 按2.3猪、鸡饲喂含抗菌药物饲料对照实验条件进行实验，将每日所采集到的猪、鸡粪便样品按2.1与2.2所描述的实验方法进行测定，所得结果以天数（d）为横坐标，药物含量（μg／kg）为纵坐标，将每天粪便中原药含量的均值与相对标准偏差作图，结果如图2所示。实验结果表明，按所设计的实验方案进行含抗菌药物饲料的饲喂可导致猪、鸡排出的粪便中含较高含量的抗菌药物；而停止饲喂后其排出粪便中的抗菌药物的含量也逐渐消除至空白水平，因此可以证明饲料中抗菌药物的超量使用是导致畜禽粪肥中的多种类抗菌药物残留的直接原因。另外，虽然不同的抗菌药物在猪、鸡粪便中残留量的消除情况有所不同，但是除盐酸金霉素外另外4种药物在停止饲喂后7d内均达到了与空白对照组相当的含量水平。

图2 猪、鸡粪便中抗菌药物含量的积累和消除结果

2.5 猪、鸡粪便堆肥发酵过程中抗菌药物降解实验结果 将空白猪、鸡粪便分别收集后自然风干，加入2.4实验中各种药物峰值时粪便中药物的含量（为方便称量计算选取近似整数值）后分别混匀作为一个研究模型，具体添加量见表4。每组取约100 kg，在地上堆成半径约为0.50 m，高度为0.40 m圆锥型粪堆，覆盖塑料薄膜进行发酵，每周对粪堆进行6个不同位置的温度测定和样品采集，并按2.1和2.2进行抗菌药物含量测定，所得结果如图3所示。实验结果表明，其中恩诺沙星、泰乐菌素和二甲氧苄啶在堆肥过程中会由于温度升高和氧化作用发生降解，其半衰期在5周左右，到10周后其含量低于检测限；金霉素和磺胺对甲氧嘧啶被少量降解，残留比例较高。

表4 猪、鸡含抗菌药物粪便模型的制作

图3 猪、鸡粪便堆肥发酵过程中抗菌药物降解规律

3 讨论

3.1 抗菌药物从饲料向畜禽粪便的迁移 通过猪、鸡饲喂含抗菌药物饲料后粪便中原型药物含量蓄积与消除实验结果可知，饲喂含抗菌素的饲料是导致畜禽粪便中抗菌药物残留蓄积的直接原因。本次实验所选择的抗菌药物包含了氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、磺胺类及磺胺增效剂类，均属于目前畜牧业常用的抗菌促生长剂，实验选择的饲喂量也是选取了常用剂量的最大值，而使用此剂量的抗菌药物已经使畜禽粪便中原药造成残留蓄积。另外，不同的药物也体现出了不同的残留蓄积与消除规律，不同动物也会对饲喂同种药物体现出不同的残留蓄积规律。比如恩诺沙星在猪粪和鸡粪中的残留检出量差异较大，推测是由于禽畜体内消化器官和代谢酶系的巨大差异造成。本次实验中停止用药后除盐酸金霉素外另外几种药物在粪便中的检出均在7 d内回到了空白水准，因此停止用药约一周后的畜禽粪便中抗菌药物残留风险较低。通过本次研究发现，在饲料中超量使用抗菌药物是导致畜禽粪便中抗菌药物残留蓄积的主要原因，因此在畜牧生产中应尽量避免超剂量、超范围使用抗菌药物，而使用抗菌药物后一周内的畜禽粪便也具有较高的抗菌药物残留量，不宜直接进行有机肥的制作。

3.2 抗菌药物从畜禽粪便向有机肥的迁移 通过猪、鸡的含抗菌素饲料饲喂实验获得了其粪便中各种抗菌药物残留量的峰值，以此峰值建立了其含抗菌药物粪便模型，通过对该模型的堆肥发酵实验，可知恩诺沙星、泰乐菌素和二甲氧苄啶大部分被降解，其通过有机肥进入土壤环境的风险相对较低；但金霉素和磺胺对甲氧嘧啶被少量降解，其残留通过有机肥进入土壤的风险较高，该结果与所查文献［8］中4种磺胺类抗菌药降解的降解率最低为9.83%的结果有一定相似性。推测主要是由于氟喹诺酮类、大环内酯类以及磺胺增效剂对环境的pH和温度变化较为敏感，容易发生水解或氧化而导致其含量下降较多；四环素类虽然也容易发生水解，但由于用量高，最终在有机肥中仍有较多残留；大部分磺胺类药物结构相对稳定，对pH和温度不敏感，不易在粪肥发酵过程中降解。本次研究表明，在饲料中超剂量使用金霉素和磺胺对甲氧嘧啶会造成其由畜禽通过机肥途径向环境土壤转移的风险，应尽可能减少其不以治疗为目的而在动物饲料中进行超剂量使用。

3.3 展望 本次研究选取的恩诺沙星、盐酸金霉素、磷酸泰乐菌素、磺胺对甲氧嘧啶和二甲氧苄啶均属于目前畜牧业常用的抗菌促生长剂，涵盖了氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、磺胺类及磺胺增效剂类。之前研究表明［9-10］，高效液相色谱串联质谱法是快捷准确的多残留检测方法，适合对多种目标化合物同时进行定性定量测定。利用该方法，通过饲喂实验与粪便堆肥实验可以研究其从养殖环节到种植环节的残留迁移规律，为评价畜禽养殖中抗菌药物的使用对环境的影响和对细菌耐药性问题的成因提供基础。

通过本次实验明确了饲料中抗菌药物是造成畜禽粪肥中抗菌药物残留的主要原因，并且部分药物会通过由畜禽粪便堆肥制作有机肥的过程进入环境土壤的残留迁移途径。下一步将通过对环境土壤和所种植物建立模型进行研究，以确定其是否有经过土壤向所种植物进行残留迁移的可能。另一方面，对含抗菌药物的畜禽粪便、有机肥以及土壤中含耐药性基因细菌进行分离鉴定，以研究抗菌药物的残留迁移是否与环境细菌的耐药性有所联系，这个研究有可能发现对耐药性细菌成因的传统见解以外的新途径。

［1］ 顾欣，张鑫，李丹妮，等.我国兽用抗菌药物使用现况及“无抗”饲养的探讨［J］.中国兽药杂志，2013，47（8）：54-57.

［2］ 李振，王云建.畜禽养殖中抗生素使用的现状、问题及对策［J］.今日畜牧兽医，2009，24（08）：1-3.

［3］ 卜仕金.欧盟禁用抗生素促生长剂的利与弊［J］.中国家禽.2006，28（13）：50～52.

［4］ 崔生辉，林兰，丁宏，等.耐药细菌产生与传播的原因［J］.中华预防医学杂志，2011，45（10）：875-877.

［5］ 韩志英，丁颖，朱军，等.畜禽养殖废弃物主要有害成份及其控制技术研究进展［J］.科技通报.2008，24（04）：559-563.

［6］ 张树清，张夫道，刘秀梅，等.高温堆肥对畜禽粪中抗生素降解和重金属钝化的作用［J］.中国农业科学，2006，39（02）：337-343.

［7］ 李彦文，莫测辉，赵娜，等.菜地土壤中磺胺类和四环素类抗生素污染特征研究［J］.环境科学，2009，（06）：1762-1766.

［8］ 何金华.堆肥对畜禽养殖废物中磺胺类药物的降解研究［D］.湖南：湖南农业大学，2012.

［9］ 吴剑平，张鑫，顾欣，等.高效液相色谱法测定饲料中盐酸赛庚啶和盐酸可乐定含量［J］.中国饲料，2014，13：33-36.

［10］吴剑平，张鑫，李丹妮，等.猪尿中盐酸赛庚啶残留指示物研究［J］.中国饲料，2014，15：28-30.

（编辑：李文平）

Research on the Migration Regularity of 5 Antibiotics Residue from Swine and Chicken Feedstuff to Organic Fertilizer

WU Jian-ping，ZHANG Xin，LI Dan-ni，YAN Feng，ZHOU Yue-rong，GU Xin∗
（Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drugs and Feedstaff，Shanghai 201103，China）

To determine the migration regularity of antibiotics residue from swine and chicken feedstuff to organic fertilizer，40swines and 200 chickens were selected and divided into two groups to do the feeding tests and fermentation experiments.The blank group was fed with only complete feed，while the test group was fed with the complete feed with 50 mg／kg chlortetracycline hydrochloride，50 mg／kg tylosin phosphate，50 mg／kg sulfametoxydiazine，150 mg／kg enrofloxacin and 10 mg／kg trimethoprim.The manure was collected in time every day，and the sample was extracted and purified，before it was analyzed by the LC-MS.The results indicated that the antibiotics residue could be tested in manure after the swine and chicken were fed with antibiotics feedstuff，and it was able to enter the manufacture of organic fertilizer.The manure models were established according to the top value of the antibiotics residue in test group manure.The fermentation experiments were done to determine the residue of antibiotics in manure.The results indicated that enrofloxacin，tylosin phosphate and trimethoprim would be degraded by the rise of temperature and oxidation with a half-life of 5 weeks and they would be lower than limit of detection after 10 weeks.But chlortetracycline hydrochloride and sulfametoxydiazine would be less degraded with a higher risk of residue migration.

2015-03-16

A

1002-1280（2015）05-0043-06

S859.79+6

上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2011）第4-9号）

吴剑平，硕士，畜牧师，从事兽药残留检测研究。

顾欣。E-mail：guxun＠sh163.net