杨娟，谢红旗，2∗，曾建国，2∗

（1.湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地联合工程中心，长沙410128 2.湖南农业大学湖南省植物功能成分利用2011协同创新中心，长沙410128）

HPLC-MS／MS法检测血根碱在鸡体内的药代动力学研究

杨娟1，谢红旗1，2∗，曾建国1，2∗

（1.湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地联合工程中心，长沙410128 2.湖南农业大学湖南省植物功能成分利用2011协同创新中心，长沙410128）

为了建立给鸡灌胃血根碱后同时测定鸡血浆中血根碱及二氢血根碱浓度的HPLC-MS／MS检测方法，并评价血根碱在鸡体内的药代动力学特征，采用甲醇提取鸡血浆中的血根碱及代谢物二氢血根碱，以0.2%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相，选用Agilent Poroshell 120 EC C18（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）色谱柱进行色谱分离，采用电喷雾离子源（ESI）三重四极杆串联质谱进行分析，多重反应监测（MRM）方式进行检测。血根碱及代谢产物二氢血根碱均在0.1～50.0 ng／mL浓度范围内与色谱峰面积呈良好线性关系，提取回收率分别为88.95%～95.81%和82.00%～87.00%；日内及日间精密度（RSD）均小于15%；血根碱在鸡体内的药代动力学参数Cmax，Tmax，MRT，CL分别为0.90± 1.053 ng／mL、0.38±0.30 h、5.11±0.74 h和44.09±3.05 h。血根碱在鸡体内血药达峰时间以及滞留在体内的平均时间较短，代谢物二氢血根碱的血药浓度是血根碱的血药浓度5.74倍，说明代谢物二氢血根碱的血药浓度远大于血根碱的血药浓度。该方法具有快速、灵敏度高、专属性强等特点，适用于同时测定鸡血浆中血根碱和二氢血根碱的血药浓度。

血根碱；二氢血根碱；鸡；药代动力学

博落回（Macleaya cordata（Wild.）R.Br）为罂粟科博落回属多年生直立草本植物，其提取物已被成功开发为首个植物源性二类新兽药药物饲料添加剂。血根碱（sanguinarine，SA）是博落回中的最主要的活性成分［1］，是季胺苯并菲啶类生物碱（QBAs），属于苄基异喹啉类生物碱中的一种；二氢血根碱（Dihydrosanguinarine，DHSA）属于异喹啉类生物碱主要存在于罂粟科博落回属［2］。已有文献报道采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chomatography，HPLC）和液相色谱质谱联用技术（LiquidChromatograph／MassSpectrometerTriple Quad，HPLC-MS）方法对博落回植物中的四种主要生物碱血根碱、别隐品碱、原阿片碱以及白屈菜红碱进行了测定［3-4］，贝俊宏等［5］采用硫酸铵梯度法测定了血根碱脂质体在大鼠体内药代动力学规律，但血根碱在禽类动物的体内药代动力学研究尚未见报道。

本文通过系统地方法学考察，建立了同时测定鸡血浆样品中的血根碱和二氢血根碱的HPLCMS／MS方法并对其在鸡血浆中代谢动力学参数进行分析。该方法的建立可用于监测血根碱和二氢血根碱在动物体内的动态血药浓度，对研究血根碱在鸡体内的药代动力学［6］和药效动力学具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 一日龄肉鸡20只雌雄各半，体重25～30 g由湖南畜牧研究所提供，鸡以基础饲料（由麦麸、玉米、大麦、稻谷、高粱等）喂养，饲喂60天左右，平均体重为1.12 kg。甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、水为Milli-Q超纯水。血根碱对照品（批号：510001-201101，中国食品药品检定研究院，≥98.0%）；二氢血根碱对照品（批号：201302，湖南美可达生物资源有限公司提供，≥98.0%）。

1.2 仪器 6460型高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent公司）；1730R低温高速离心机（Hermle公司）；Agilent Poroshell 120 EC C18色谱柱（美国Agilent公司）；UGC 45C型氮吹仪（北京优晟联合科技有限公司）；QL-901型涡旋混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；DAS3.0药代动力学软件。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 准确称取一定量的血根碱（SA）和二氢血根碱（DHSA）对照品，用甲醇溶解后将其定容成质量浓度为100.0 ng／mL的对照品储备液。继续用甲醇稀释为分别含有SA和DHSA质量浓度为0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 ng／mL的混合对照溶液，冰箱4℃内保存备用。

1.3.2 色谱条件 根据参考文献［7］方法并改进，确定为：采用Agilent Poroshell 120 EC C18（2.1×150 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相为0.2%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～4 min，28%～50%B；4～6 min，50%～65%B；6～12 min，65%B；12～20 min，65%～28%B；20～25 min，28%B；柱温为35℃；流速为0.3 ng／mL；进样量为2 μL。

1.3.3 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正离子检测模式，喷雾电压：35 psi，毛细管电压：4000 V，干燥气的温度：350℃，EMV：200 V，脱溶剂气和雾化气均为氮气，干燥气流量：10 L／min，雾化气压力：45 psi，检测方式：多重反应监测（MRM）。碰撞能量、定性离子对及定量离子对等参数如表1所示。

表1 血根碱和二氢血根碱的色谱保留时间和定性、定量离子参数

1.3.4 给药方案和血样采集 肉鸡6只，以浓度为30 mg／kg的剂量［8］灌胃给予血根碱的蒸馏水溶液，给药前禁食不禁水12 h，期间使其自由饮水。给药前取鸡空白血，给药后分别于0.25、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、5、8、10、24 h鸡翅静脉丛取血0.5 mL，于加有50 μL1%的肝素钠生理盐水溶液的EP管内，3500 rpm离心10 min，使血浆分离，取上清液转入1.5 mL EP管中，冰箱-20℃保存。

1.3.5 血浆样品预处理 取鸡血浆100 μL置于1.5 mL EP管中，加入500 μL甲醇，涡旋4 min，充分沉淀蛋白；13000 rpm离心12 min，取上清液转入1.5 mL EP管中；再往沉淀中分别加入500 μL甲醇，涡旋4 min，充分沉淀蛋白。13000 rpm离心12 min，取上清液。合并两次上清液，于50℃水浴氮气吹干，所得残渣以200 μL甲醇溶解，涡旋2 min混匀，13000 rpm离心12 min，取上清液过0.22 μm的膜之后用于HPLC-MS／MS分析，记录色谱图。

1.3.6 方法学考察 试验对色谱质谱条件进行了方法学的考察，分别有：方法的专属性、标准曲线与定量下线、提取回收率、准确度和精密度以及稳定性的考察。

1.3.7 数据分析 将所得的SA在鸡体内的血药浓度-时间关系用DAS 3.0药代动力学软件处理，计算SA在鸡体内的药代动力学参数。

2 结果与分析

2.1 方法学结果 经方法学的考察，结果表明，在选定的色谱条件下，SA和DHSA可实现很好的分离见图1，血浆中的内源性物质和代谢物不干扰待测物质SA和DHSA的测定，表明本方法专属性良好。经拟合得线性回归方程分别为SA：y＝179.85x+34.079，R2＝0.9997；DHSA：y＝322.07x+32.972，R2＝0.9998；结果表明该方法在0.1～50.0 ng／mL范围内SA和DHSA的线性关系良好，SA和DHSA的定量下限均为0.067 ng／mL。经测定，该方法两种生物碱的低、中、高三个浓度的提取平均回收率分别为90.2±5.1%，85.2±2.5%，均大于80%，均符合生物样品分析方法要求。日内精密度和日间精密度的RSD分别为3.4%和4.7%，准确度（RE）结果见表2，结果（表2）表明该分析方法具有良好的准确度和精密度。经处理后的血浆样品室温放置10 h后血浆浓度的RE在±8.93%内，-20℃冰箱保存20 d血浆浓度的RE在±12.34%内，可保证样品的分析测定。

图1 （a）鸡空白血浆样品、（b）鸡空白血浆加标准品、（c）给药后鸡血浆样品的代表性色谱图

2.2 血根碱及其代谢物二氢血根碱的药-时曲线以及血根碱的主要药代动力学参数 鸡灌胃血根碱，按上述时间点采集血样，经处理后进行LC-MS分析。鸡血浆样品测定过程中，进行双样本分析，每天随行一条标准曲线，同时伴随测定高、中、低三个浓度的质控血浆样品。只有当QC样品RSD＜15%时，当日取得的数据可接受。根据不同时间点的数据，对血根碱及代谢物二氢血根碱在鸡血浆内随时间的浓度变化进行分析见图2，并计算了血根碱的主要药代动力学参数见表3。

表2 鸡血浆中血根碱测定方法的准确度

表3 鸡灌胃30 mg／kg血根碱后主要药代动力学参数

图2 鸡单次灌胃血根碱后的SA及代谢物DHSA平均血药浓度-时间曲线（mean±SD，n＝6）

3 讨论与小结

研究表明，血根碱经具有抗菌、杀虫、改善肝功能和抗肿瘤等药理作用，可抑制胆碱酯酶活性，加强心脏活动、刺激唾液分泌，并具有利尿、外周抗肾上腺素解交感作用。而目前有关血根碱的研究报道，绝大多数都是集中在血根碱提取分离方法、药理作用方面，缺少相关的临床前研究资料，尤其是关于其药物动力学及其代谢资料。所以，探讨血根碱作为中兽药在动物体内的药物动力学行为，有利于弄清其药理作用机理及作用过程，对于指导新药设计，提高新药疗效和安全性，科学地制定药品质量标准均具有重要意义。为促进血根碱新药的开发和利用，更好地了解血根碱药理作用的机理及过程，对血根碱在动物体内的药物动力学过程进行相关研究是很有必要的。

本试验结果显示，鸡灌胃给药后，血根碱在鸡体内的药代动力学参数Cmax、Tmax、MRT、CL分别为0.90±1.053 ng／mL、0.38±0.30 h、5.11±0.74 h和44.09±3.05 h；说明鸡在灌胃15 min后达到最大血药浓度浓可达0.90±1.053 ng／mL，随后随时间延长血药浓度逐渐降低；而其MRT平均驻留时间为5.11±0.74 h，说明灌胃后血根碱滞留在体内的平均时间较短；从血根碱及其代谢物二氢血根碱的药时曲线可看出：两者在鸡体内达到最大血药浓度的时间相当，而代谢物二氢血根碱的血药浓度远大于血根碱的血药浓度，有研究表明：血根碱在动物体内的还原代谢物为二氢血根碱［9］，这说明在鸡体内血根碱在还原酶的作用下转化为二氢血根碱的形式存在；而代谢物二氢血根碱的血药浓度是血根碱的血药浓度5.74倍，这说明血浆中代谢物二氢血根碱的浓度最高值比血根碱的最高值要高。

植物源性药物饲料添加剂博落回提取物散通过对靶动物鸡灌胃后，在血浆中检测到了其主要成分及其初级代谢物的残留。而鸡灌胃血根碱10 h之后，在鸡血浆中基本检测不到血根碱以及二氢血根碱的存在，说明其在鸡体内的代谢较快，至于其是否在其他组织和器官中有残留，还有待进一步的研究。以30 mg／kg浓度的血根碱灌胃，试验过程中鸡未见明显不良反应或死亡，提示此剂量安全。后期还可对药物浓度进行高、中、低剂量设置，来完善药代动力学研究。

本试验所建立的HPLC-MS方法能够同时检测血根碱以及其初级还原代谢产物，方法学考察结果表明该方法具有专属性好、准确度高、精密度好和灵敏度高等特点，故本方法适用于血根碱和二氢血根碱在动物体内的血药浓度的测定和药代动力学研究。

［1］ 万学攀.博落回生物碱成分分离及抑菌活性研究［D］.硕士学位论文.杨凌：西北农林科技大学，2008.

［2］ Tanahashi T，Zenk M H.phenanthridine alkaloids from Eschscholtzia californica cell suspension cultures［J］.J Nat Prod，1990，53（3）：579-586.

［3］ Ying-Zhuang Chen，Guo-Zhu Liu，Yao Shen，et al.Analysis of alkaloids in Macleaya cordata（Willd.）R.Br.using highperformance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionization mass spectrometry.［J］.J Chromatogr.A，2009，1216：2104-2110.

［4］Xu-Biao Luo，Bo Chen，Shou-ZhuoYao.Rapid determination of protopine，allocryptopine，sanguinarine and chelerythrine in fruits of Macleaya cordata by microwave-assisted solvent extraction and HPLC-ESI／MS.［J］.Phytochem Anal，2005，17（6）：431-438.

［5］ 贝俊宏，柯学，黄志峰，等.血根碱脂质体的制备与大鼠体内药动学［J］.药学与临床研究，2010，18（1）：42-45.

［6］ El-Gendi A Y I，Atef M，Aziza M M.Pharmacokinetic and tissue distribution of doxycycline in broiler chickens pretreated with either：Diclazuril or halofuginone［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48：3209-3214.

［7］ 冯宋岗，曾建国.HPLC-MS／MS法检测猪肉中苯并菲啶类生物碱的研究［J］.中国兽药杂志，2014，48（4）：48-51.

［8］ 肖利.博落回提取物抗肝纤维化的药效学及血根碱的药动学研究［D］.硕士学位论文.长沙：湖南中医药大学，2012.

［9］ Pavel Kosina，Jan Vacek.Identification of benzo phenanthridine metabolites in human hepatocytes by liquid chromatography with electrospray ion-trap and quadrupole time-of-flight mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2011，10：1077-1085.

（编辑：陈希）

The Pharmacokinetics Study of Sanguinarine in Broiler using HPLC-MS／MS

YANG Juan1，XIE Hong-qi1，2∗，ZENG Jian-guo1，2∗
（1.National and Provincial Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative，Hunan Agricultural University，Changsha 410208，China；2.Hunan 2011 Co-Innovation Center for Utilization of Botanicals Functional Ingredients（Hunan），Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

To establish a sensitive HPLC-MS／MS method for simultaneous determination the concentration of sanguinarine and dihydrosanguinarine in broiler plasma after oral administration of sanguinarine，and the pharmacokineticcharacteristicsofsanguinarinewereevaluated.Sanguinarineanditsmetabolites dihydrosanguinarine were extracted from plasma with methanol，then separated on an Agilent Poroshell 120 EC C18 column using water-0.2%formic acid（A）and acetonitrile（B）as mobile phase.Electrospray ionization（ESI）source was applied and operated in multiple reaction monitoring（MRM）mode.The linear calibrationcurve was obtained in the concentration range of 0.1～50 ng／mL for sanguinarine and its metabolites dihydrosanguinarine，The extraction recoveries were 88.95%～95.81%and 82%～87%for sanguinarine and dihydrosanguinarine respectively.The inter-and intra-day precisions were less than 15%.The pharmacokinetic parameters of sanguinarine were as follows：Cmax＝0.90±1.053ng／mL，Tmax＝0.25±0.38h，MRT＝5.11±0.74 h，CL＝44.09±3.05 h.The time to peak of plasma and the average time of residence in the body were short；the plasma concentrations of metabolites dihydrosanguinarine is 5.74 times as high as that of sanguinarine；it shows that the plasma concentrations of metabolites dihydrosanguinarine is much higher than that of sanguinarine.The method was shown to be effective，convenient and suitable for simultaneous pharmacokinetic study of sanguinarine and dihydrosanguinarine in broiler plasma.

sanguinarine；dihydrosanguinarine；broiler；pharmacokinetic

2015-03-16

A

1002-1280（2015）05-0022-05

S859.79

湖南省科技重大专项（20121004FJ），国家科技支撑项目（2011BAD34B02）

杨娟，硕士研究生，从事功能产品的开发与评价方面研究。

曾建国，E-mail：ginkgo＠world-way.net；谢红旗，E-mail：xiehongqi2006＠sohu.com