彭 亮,李诒光,2*,陈 杰*,饶 毅,季巧遇,魏惠珍

(1.江西中医药大学,江西 南昌 330006；2.江中药业股份有限公司,江西 南昌330096)



陕西平利地区绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱研究

彭 亮1,李诒光1,2*,陈 杰1*,饶 毅1,季巧遇1,魏惠珍1

(1.江西中医药大学,江西 南昌 330006；2.江中药业股份有限公司,江西 南昌330096)

目的：建立陕西平利地区绞股蓝黄酮类成分的HPLC指纹图谱。方法：采用反向高效液相色谱法，色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；柱温：30℃；检测波长：360nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。结果：10批绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱中共标定了26个共有指纹特征峰，其中2个色谱峰确定为芦丁和槲皮素，且10批药材的相似度均达到0.98以上。结论：该方法稳定、可靠，精密度高，重复性好，可为绞股蓝药材的质量控制提供依据。

绞股蓝；陕西平利；黄酮类成分；HPLC；指纹图谱

绞股蓝为葫芦科绞股蓝属多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.的根茎或全草[1-3]，又名七叶胆、天堂草、遍地生根等。该属植物基源复杂、品种繁多，全世界约有16种和3变种，我国有14种和3变种[4]，广泛分布于陕西、湖北、安徽、福建、云南、广西等地。其味苦微甘，性凉；归肺、脾、肾经，具有清热解毒、化痰止咳、益气健脾、养阴生津、养心安神等功效[5]。现代研究表明，黄酮类成分是绞股蓝的主要化学成分，具有抗氧化、清除自由基、抗癌防癌、改善心脑血管循环和调节血压等作用[6-8]。绞股蓝作为一种与人参相似的免疫增强剂，有“南方人参”的美誉，民间称其为神奇的“不老长寿药草”，在保健食品和新型药品研发上都有巨大的应用前景，是一种新的药食两用植物资源[9-12]。目前，关于陕西平利地区绞股蓝药材黄酮类成分指纹图谱研究未见文献报道，为进一步评价该地区绞股蓝药材质量，本研究建立了陕西平利产地绞股蓝黄酮类成分的HPLC指纹图谱，并对10批绞股蓝黄酮类成分的HPLC指纹图谱进行评价分析，以便能更加全面地反映该地区绞股蓝药材的质量现状，为绞股蓝药材的质量控制和道地药材GAP实施提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，包括 G1379A 在线真空脱气机、G1311A 四元泵、G1367A 自动进样器、G1316A 柱温箱和 G1315B DAD检测器；SK5200LH超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；AB204-N型精密分析天平(METTLER TOLEDO上海衡器有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.2 试药

绞股蓝药材经鉴定为葫芦科绞股蓝属多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的根茎或全草，药材来源见表1。芦丁对照品(批号为100080-200707，中国食品药品检定研究院)，槲皮素对照品(批号为100081-200907，中国食品药品检定研究院)。甲醇、乙腈为色谱纯；水为娃哈哈饮用纯净水；其它试剂均为分析纯。

表1 绞股蓝药材样品来源

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

取芦丁、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成含芦丁253.5μg·mL-1、槲皮素3.62μg·mL-1的对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取绞股蓝药材干燥粉末(过四号筛)约1.0g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去石油醚液，药渣连同滤纸挥干溶剂，移入具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，称定重量，回流提取1.0h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，过滤，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱 (150mm×4.6mm，5μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见表2。柱温：30℃；检测波长：360nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。

2.4 测定方法

分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件测定，记录55min色谱图。供试品色谱图中，以芦丁峰作为参照峰(s)，指定其相对保留时间和相对峰面积为1，计算其它特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的比值。

表2 梯度洗脱条件

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 取同一份绞股蓝供试品溶液，按“2.3”项所述色谱条件连续进样6次，并记录色谱图。选取芦丁色谱峰作为参照峰，计算其他特征峰对其的相对保留时间和相对峰面积。结果各特征峰的相对保留时间RSD值小于0.33%，相对峰面积RSD值小于4.77%。结果表明，该方法精密度良好。

2.5.2 稳定性考察 取绞股蓝药材干燥粉末(批号：2014.02.19，过四号筛)，按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件在0、2、4、8、12、24h依次进样，记录不同时间的色谱图，计算各特征峰相对于芦丁峰的相对保留时间值和相对峰面积值。结果各特征峰的相对保留时间RSD值小于0.15%，相对峰面积RSD值小于4.98%。结果表明，样品在24h内稳定性良好。

2.5.3 重复性考察 取同一批绞股蓝药材干燥粉末(批号：2014.02.19，过四号筛)6份，按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图。计算各特征峰相对于芦丁峰的相对保留时间值和相对峰面积值。结果各特征峰的相对保留时间RSD值小于0.29%，相对峰面积RSD值小于4.86%。结果表明，所建立的指纹图谱方法能够实现较好的重复性。

2.6 指纹图谱及技术参数

2.6.1 绞股蓝黄酮类成分指纹图谱建立 按“2.2”项下供试品溶液制备方法和“2.3”项下色谱条件分析陕西平利地区的10批绞股蓝药材，得到10批绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱，见图1。55 min内有26个特征指纹峰是10批绞股蓝药材所共有，每张指纹图谱中所选共有峰的峰面积总和大于总峰面积的90%。

2.6.2 特征指纹峰的标定 根据相对保留时间标定特征指纹峰，对10批绞股蓝HPLC-FPS测定结果进行比较分析，发现26个特征峰是10批绞股蓝所共有，因此确定这26个峰为特征指纹峰。其中，通过对照品HPLC图谱确定1号峰为芦丁，14号峰为槲皮素，见图2。以1号峰(芦丁)为参照峰，计算其他特征峰相对于1号峰的相对保留时间和相对峰面积，见表3、表4。

图1 陕西平利地区10批绞股蓝黄酮类成分对照指纹图谱

图2 绞股蓝黄酮类成分HPLC指纹图谱

2.7 相似度评价

采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版)”，对10批绞股蓝药材进行相似度评价分析，以中位数生成参照谱，时间窗宽度为0.02。结果表明：10批绞股蓝药材指纹图谱相对参照谱的相似度结果分别为0.995、0.998、0.995、0.997、0.991、0.988、0.994、0.984、0.995、0.993。由相似度结果可知，10批药材的指纹图谱与对照谱相比较，其相似度均达到0.98以上，表明药材质量稳定，差异较小。

3 讨论

采用HPLC-UV检测分析发现，在360nm波长处指纹峰较多，多数特征成分的响应值较大，而且基线较平稳，故选择360nm波长作为指纹图谱检测波长。本实验分别采用甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液进行梯度洗脱。结果表明，在乙腈-0.2%磷酸水溶液的流动相中，各色谱峰的分布、峰形和分离度均优于其他流动相系统，因此，选择乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相。

实验以尽可能多体现绞股蓝中黄酮成分为原则，以提取溶剂、提取方式、提取时间为优化对象，采用单因素试验确定绞股蓝药材中黄酮类成分提取的最佳条件，最终确定了以石油醚回流除去脂溶性干扰性成分，再以70%甲醇回流提取1.0h效果最好。

通过对10批陕西平利绞股蓝药材HPLC指纹图谱的分析结果可知，各色谱峰的保留时间匹配较好，且各特征峰的相对含量分布相似，10批绞股蓝药材的总相似度均达到0.98以上，所建立的HPLC指纹图谱可用于辨别不同产地的绞股蓝药材。

表3 10批绞股蓝指纹图谱中共有特征峰相对保留时间

表4 10批绞股蓝指纹图谱中共有特征峰相对峰面积

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(责任编辑：魏 晓)

Study on the HPLC Fingerprint Spectrum of Flavonoids inGynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino from Shanxi PingLi

Peng Liang1,Li Yiguang1,2*,Chen Jie1*,Rao Yi1,Ji Qiaoyu1,Wei Huizhen1

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China;2.Jiangzhong Pharmaceutical Corporation,Nanchang 330096,China)

Objective:To establish the HPLC fingerprint spectrum of flavonoids inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.Methods:HPLC was performed on ZORBAX SB-C18column (150mm×4.6mm,5μm),gradiently eluting with acetonitrile as mobile phase A,and 0.2% H3PO4as B at a flow rate of 1.0mL/min.The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 360nm.The injection volume was 10μL.Results:Twenty-six common characteristic peaks were demarcated among ten batches ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.Two chromatographic peaks were identified as rutin and quercetin and the similarities of ten batches ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino were above 0.98.Conclusion:The established method is simple,accurate and can be able to provide reference for quality control ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.

Shanxi PingLi；GynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino；Flavonoids；HPLC；Fingerprint Spectrum

2015-05-08

彭亮(1990-),男,江西中医药大学硕士研究生,研究方向为中药质量控制。

李诒光(1974-),男,江中药业股份有限公司主任中药师，研究方向为中药质量评价与开发，E-mail:lyg@jzjt.com；陈杰(1975-),女,江西中医药大学副教授,研究方向为中药质量评价与开发，E-mail:813680107@qq.com。

R284.1

A

1673-2197(2015)19-0019-04

10.11954/ytctyy.201519009