虞凤慧，马韵升，刘圣鹏，徐泽平，3 *，李 锋，刘结磊

（1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨州 256500；2.山东京博控股股份有限公司，山东 滨州 256500；3.滨州市环境微生物技术工程研究中心，山东 滨州 256500）

脂肪酶（1ipase，EC3.1.1.3）全称即三酰基甘油酰基水解酶，能在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换[1-3]、多肽等有机合成反应[4]，是目前被重点研究的酶催化剂[5-6]。随着研究的逐渐深入，脂肪酶的生产技术日趋成熟，应用越来越广，但游离脂肪酶存在易失活、不易回收[7]、难重复使用等问题[8]。因此，在有机反应体系中，游离脂肪酶作为催化剂难以大规模应用。而固定化酶可解决以上问题，与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时[9-10]，又呈现操作稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控和工艺简便等优点[11-13]，已成为目前研究的热点之一。近年来，脂肪酶固定化的研究日益增加，并广泛应用于食品、洗涤剂、油脂和制药等领域，在生物柴油制备方面也有重要应用[14]。

脂肪酶固定化的方法主要有包埋法、吸附法、共价结合法和交联法等[14-17]。包埋法具有不改变酶的结构、酶活收率高等优点，且包埋常用载体-海藻酸钠，因其价格低廉、具有良好的生物相溶性而受到广泛重视[11]。目前，海藻酸钠单独作为固定化载体的研究较多，而海藻酸钠与羧甲基纤维素钠共同作为载体的报道还不多见。本研究拟采用包埋法、以海藻酸钠和羧甲基纤维素钠为复合载体进行脂肪酶的固定化，通过单因素及正交试验筛选最优的固定化条件，期望为固定化脂肪酶的生产及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脂肪酶为毕赤酵母产高温碱性脂肪酶（70 kU/mL）：实验室自制；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-1型数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；85-2型数显恒温磁力搅拌器：江苏金坛城东光芒仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶的固定化

分别称取一定质量的海藻酸钠和羧甲基纤维素钠，用蒸馏水加热溶解，配成一定含量的混合溶液，冷却后加入一定量的脂肪酶粗酶液，使总酶活为200 U，搅拌、混匀、静置。用注射器将无气泡的混合溶液逐滴加入0.1 mol/L CaCl2溶液中，固化30 min。纱布过滤，用蒸馏水洗净固定化颗粒，滤纸吸干水分，测定固定化酶酶活，计算酶活收率。

1.3.2 脂肪酶固定化条件的优化

分别考察不同固定化载体、载体含量、加酶量、CaCl2浓度及固定化时间对脂肪酶固定化的影响，以固定化酶酶活收率为指标，筛选各个单因素试验的最佳条件。

根据单因素试验结果，选择影响脂肪酶固定化的主要因素，进行正交设计，以固定化酶酶活收率为评价指标，筛选最优的固定化条件。

1.3.3 酶活力及酶活收率的测定

游离脂肪酶酶活力测定：参照GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》中指示剂滴定法。酶活定义：1 mL液体酶（或1 g固体酶粉），在40 ℃温度和pH 7.5条件下，1 min水解底物产生1 μmol可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以U/mL（U/g）表示。

固定化脂肪酶酶活力测定：按照游离脂肪酶酶活力测定方法。酶活收率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 不同载体对脂肪酶固定化的影响

分别选择海藻酸钠、海藻酸钠-明胶（3∶1）、海藻酸钠-PEG600（3∶1）、海藻酸钠-聚乙烯醇（3∶1）、海藻酸钠-羧甲基纤维素钠（3∶1）为包埋载体，进行脂肪酶的固定化，载体终含量为1.5%，结果见图1。由图1可知，以海藻酸钠和羧甲基纤维素钠为复合载体时，脂肪酶的固定化效果最好，固定化酶酶活收率最高，为34.20%。因此，选择海藻酸钠-羧甲基纤维素钠复合载体进行后续脂肪酶固定化研究。

2.2 海藻酸钠含量对脂肪酶固定化的影响

海藻酸钠含量过大或者过小，都会显著影响酶的固定化效果。因此，固定羧甲基纤维素钠的含量为0.4%，筛选出海藻酸钠的最佳含量。分别设定海藻酸钠含量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，进行脂肪酶的固定化，结果见图2。由图2可知，海藻酸钠含量为1.0%时，脂肪酶的固定化效果最好，固定化酶酶活收率为42.55%。因此，确定海藻酸钠最佳含量为1.0%。

图2 海藻酸钠含量对脂肪酶固定化的影响Fig.2 Effect of sodium alginate content on lipase immobilization

2.3 羧甲基纤维素钠含量对脂肪酶固定化的影响

固定海藻酸钠含量为1.0%，分别设定羧甲基纤维素钠含量为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，进行脂肪酶的固定化，结果见图3。由图3可知，羧甲基纤维素钠含量为0.4%时，固定化酶酶活收率为58.35%，因此，确定羧甲基纤维素钠最佳含量为0.4%。

图3 羧甲基纤维素钠含量对脂肪酶固定化的影响Fig.3 Effect of carboxymethyl cellulose sodium content on lipase immobilization

2.4 加酶量对脂肪酶固定化的影响

固定上述最佳条件，分别设定脂肪酶添加量为50 U/（g载体）、100 U/（g载体）、150 U/（g载体）、200 U/（g载体）、400 U/（g载体）、800 U/（g载体），研究加酶量对脂肪酶固定化效果的影响，结果见图4。由图4可知，加酶量为100 U/（g载体）时，固定化酶酶活收率最高，随着加酶量的逐渐增加，酶活回收率呈明显的下降趋势。因此，确定加酶量为100 U/（g载体）。

图4 加酶量对脂肪酶固定化的影响Fig.4 Effect of enzyme amount on lipase immobilization

2.5 CaCl2浓度对脂肪酶固定化的影响

固定上述最佳条件，分别设定CaCl2溶液浓度为0.1mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L，研究CaCl2溶液浓度对脂肪酶固定化效果的影响，结果见图5。由图5可知，CaCl2溶液浓度为0.2 mol/L时，固定化酶酶活收率最高。因此，确定CaCl2溶液最佳浓度为0.2 mol/L。

图5 CaCl2浓度对脂肪酶固定化的影响Fig.5 Effect of CaCl2concentration on lipase immobilization

2.6 固定化时间对脂肪酶固定化的影响

图6 固定化时间对脂肪酶固定化的影响Fig.6 Effect of immobilization time on lipase immobilization

固定上述最佳条件，分别设定固定化时间为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，研究固定化时间对脂肪酶固定化效果的影响，结果见图6。由图6可知，随着固定化时间的延长，固定化酶酶活收率呈先增加再减少后趋于稳定的趋势，30 min为最佳固定化时间。

2.7 脂肪酶固定化条件优化正交试验

根据单因素试验结果，以海藻酸钠含量、羧甲基纤维素钠含量、加酶量、CaCl2浓度和固定化时间为5个影响因素，以固定化酶酶活收率为评价指标，设计L16（45）正交试验，因素与水平见表1，结果与分析见表2，方差分析结果见表3。

表1 脂肪酶固定化条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for lipase immobilization conditions optimization

表2 脂肪酶固定化条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for lipase immobilization conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影响固定化酶酶活收率的因素主次关系为RC＞RA＞RE＞RD＞RB，即酶与载体配比＞海藻酸钠含量＞固定化时间＞CaCl2浓度＞羧甲基纤维素钠含量。最佳组合为A2B2C1D4E3，即脂肪酶的最优固定化条件为海藻酸钠含量1.0%、羧甲基纤维素钠含量0.25%、加酶量50 U/g载体、CaCl2浓度0.4 mol/L，固定化时间40 min。并在此最优固定化条件下进行验证试验，得到固定化脂肪酶酶活收率达99.50%。由表3可知，加酶量对固定化酶酶活收率有显著影响，海藻酸钠含量、羧甲基纤维素钠含量、CaCl2浓度和固定化时间对固定化酶酶活收率影响均不显著。

3 结论

本研究采用包埋法进行了脂肪酶的固定化研究。以海藻酸钠和羧甲基纤维素钠为复合载体，通过单因素及正交试验对固定化条件进行了优化，得到最优固定化条件为海藻酸钠浓度为1.0%、羧甲基纤维素钠浓度为0.25%、加酶量为50 U/（g载体）、CaCl2浓度为0.4 mol/L，固定化时间40 min。期望为固定化脂肪酶的研究及生产提供理论依据。

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