降胆固醇红曲霉菌株的分离及其降解性能研究

2015-04-23肖连冬王志强

中国酿造 2015年5期

肖连冬，王志强

（1.南阳理工学院生物与化学工程学院，河南南阳 473000；2.南阳市质量技术监督检验测试中心，河南南阳 473000）

胆固醇是人体组织细胞不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素D以及甾体激素的原料，但人体内血清胆固醇过高会引起动脉硬化和心脏病。研究表明，高胆固醇膳食与心血管疾病发病率有关系，降低胆固醇含量可相应减少冠心病的发病率和死亡率[1-3]。因此，降低食品中的胆固醇，开发低胆固醇食品对减少动脉硬化和冠心病的发生、提高人们的生存质量具有重要意义[4]。目前国内外研究有两方面：①利用物理方法、化学方法或生物方法脱除食品中的胆固醇；②开发食用后能在体内通过某种作用减少血清胆固醇含量的食品或药品。其中，依靠微生物作用为主的生物方法因其效率高、成本较低且能较好保留食品原有营养成分及风味而得到研究者的青睐[5-7]。1979年，日本学者远腾章发现红色红曲霉（Monascus）能产生强降胆固醇物质莫纳可林（Monacolin）K，微生物学家们也对它的药用生理价值进行了研究探讨[8]。我国对降胆固醇红曲霉的研究相对落后，一是缺乏优良的红曲霉菌株，二是培养工艺欠佳。因此进行红曲霉菌株的分离筛选和研究应用具有非常重要的现实意义。本研究以红方豆腐乳为菌源材料，通过平板分离、形态特征和降胆固醇试验，筛选出能够有效降解胆固醇的红曲霉菌株，为其在食品加工行业中的应用及有效降解胆固醇的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

红方豆腐乳：市售；大麦芽：南阳天冠啤酒有限公司。

1.1.2 培养基

麦芽汁培养基：取粉碎的麦芽粉加入4倍质量的水调浆，在恒温水浴锅中65 ℃糖化3 h，煮沸后两层纱布过滤，乳酸调pH至4.5～5.5，于121 ℃灭菌20 min。

富集培养基：在麦芽汁培养基中加入适量乙醇和链霉素。

分离培养基：用麦芽汁培养基。7～8°Bé麦芽汁，可溶性淀粉2%，蛋白胨0.5%，琼脂2%，121 ℃灭菌20 min。

初筛培养基：在麦芽汁培养基中加入经干燥研碎的蛋黄（6 g/1 000 mL）。

发酵培养基：葡萄糖50 g，谷氨酸单钠盐（或组氨酸）5 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，CaCl20.1 g，K2HPO45 g，KH2PO45 g，MnSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，酵母膏10 g，pH 5.0，加入胆固醇（0.3 mg/mL）用水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 化学试剂

胆固醇（纯度99.5%）：普博欣生物科技有限责任公司；石油醚、无水乙醇、甲醇、氢氧化钾、冰醋酸、浓硫酸、磷酸、硫酸铁铵等均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

CX31RTSF奥林帕斯生物显微镜：Philippines公司；HZQ-Q振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；PYX-PHS-50隔水式电热恒温培养箱、HHS21-4型电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；BS110S型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；SW-CJ-1CU双人单面水平净化工作台：上海博迅实业有限公司；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；721可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；TDL-4013台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 红曲霉菌株分离

富集培养：取适量红方豆腐乳汁加入麦芽汁培养基中，同时加入适量体积分数为95%的乙醇和链霉素，30～32 ℃培养一定时间后转入相同培养基继续培养，反复2～3次。

分离与纯化：采用麦芽汁固体培养基稀释平板分离，30～32 ℃培养4 d，形成单菌落。根据菌落形态，挑取平板上长出的单菌落反复进行纯化，直至无杂菌出现为止。红曲霉的形态特征为菌丝体初期无色，渐变为红色至紫红色，菌丝体大量分枝，分枝的顶端产生单个或成串的分生孢子，孢子呈球形或椭圆形，闭囊壳橙红色，近球形，含有多数子囊，子囊内含8个孢子，子囊孢子呈卵形或近球形，光滑、透明、无色或漆红色，挑取符合红曲霉形态特征的菌种分离纯化[9-11]。

1.3.2 降胆固醇菌株的初步筛选

将分离菌株接种于麦芽汁培养基，32 ℃培养4 d作为种子，以5%接种量分别接入初筛培养基，在相同条件下培养一定时间，加入0.2 mL的铁矾显色剂显色，并与未接种培养基比较，根据颜色的深浅判断其能否降胆固醇及其降解效果，初步选出降胆固醇菌株。

1.3.3 胆固醇降解试验

将初筛得到的能降解胆固醇的菌株进行胆固醇降解试验，采用与初筛相同的培养方法进行发酵降解，用直接皂化-比色法定量测定菌株降胆固醇能力，以确定不同发酵方式、不同发酵时间对胆固醇降解率的影响。

1.3.4 胆固醇测定方法

胆固醇降解定性分析采用铁矾显色剂显色法[12]：取2 mL菌株初筛培养液于试管中，加入0.2 mL的铁矾显色剂显色，各管与未经培养的培养基相比，根据颜色的深浅判断其降解效果，初步筛选出高效菌株。

胆固醇降解定量分析采用皂化比色法[13-15]：取5 mL培养液，加入5 mL KOH-甲醇溶液（200 g/L）振荡混合均匀后，放入80 ℃水浴中，皂化30 min，并不停振荡，将皂化混合物冷却至20 ℃，加入10 mL石油醚振荡萃取数分钟，静置，分层后将上层液移入10 mL离心管中，2 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL于试管中，在85 ℃水浴下挥发干溶剂，然后向试管中加入3 mL冰乙酸溶解残余物，再加3 mL铁矾显色剂，在60 ℃水浴中显色15 min，用分光光度计于波长490 nm处测其吸光度值（OD）。

1.3.5 胆固醇标准曲线的绘制

准确称取硫酸铁氨4.463 0 g，用85%的磷酸定容至100 mL，配制成铁矾显色剂储备液，吸取20 mL储备液，用硫酸定容至250 mL，配制成铁矾显色剂工作液。

准确称取胆固醇标准品100 mg，溶于石油醚中，并定容至50 mL，配制质量浓度为2 g/L的胆固醇储备液。吸取胆固醇标准储备液5 mL，并用石油醚定容至50 mL，配制质量浓度为0.2 g/L的胆固醇工作液。

胆固醇标准曲线的制作：准确吸取胆固醇工作液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL分别置于8支试管中，置于85 ℃水浴中挥发干溶剂，在各管中加入冰乙酸5 mL，沿管壁加3 mL铁矾显色液，混匀，60 ℃水浴中显色15 min，在波长490 nm处测定吸光度值。根据标准曲线方程求出胆固醇的含量，计算出降解率，其计算公式如下：

式中：C0为原始培养基中胆固醇的含量；mg/mL；C1为培养后培养基中胆固醇含量，mg/mL。

2 结果与分析

2.1 胆固醇标准曲线的建立

以胆固醇质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线，结果见图1。

图1 胆固醇标准曲线Fig.1 Standard curve of cholesterol

由图1可知，标准曲线方程为y=9.983 8x-0.000 7，相关系数为R2=0.999，表明二者线性关系良好。

2.2 红曲霉菌株的分离纯化及形态观察

通过分离得到两株红曲霉菌株X1和X2。两株红曲霉在麦芽汁琼脂上的生长良好，菌落初为白色，后变为淡粉色、紫红色，其菌落形态特征见表1。

表1 红曲霉菌株的菌落形态特征Table 1 Morphological features of Monascus colony

在显微镜下观察其个体形态可见，两株菌的菌丝均无横隔，多核，有分枝。随着培养时间延长，菌丝壁增厚，菌丝增粗，并由菌丝形成分生孢子。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或成串生长，呈糖葫芦状。闭囊壳呈球形，有长短不一的柄。红曲霉菌丝、闭囊壳、分生孢子等显微观察结果分别见图2～图3。

图2 红曲霉菌株X1(a)和X2(b)菌丝形态Fig.2 The hypha morphology of X1(a) and X2(b)

图3 红曲霉X1(a)和X2(b)分生孢子形态Fig.3 The conidiospore morphology of X1(a) and X2(b)

将两菌株分别接种到含乙醇的麦芽汁试管中进行培养，长出的菌产红色色素、菌丝成团，符合红曲霉的生态习性。

通过分离菌株X1、X2菌落形态特征与显微形态特征与红曲霉（Monascus）的属征[16]相比较，两者相吻合，再结合郑虹[17]对红曲霉的有关描述，可以证实分离的X1、X2菌株为红曲霉属真菌。

2.3 降胆固醇菌株的初筛

对所分离出的两株红曲霉在含蛋黄6 g/1 000 mL的初筛培养基中进行培养，通过铁矾显色剂显色观察颜色变化情况。因为胆固醇的浓度和显色颜色深浅有关，胆固醇浓度越高，显色后颜色越深，从而判断其是否降胆固醇的能力。在32 ℃下，分别静置培养3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，并与刚接种的培养基进行比较，两菌株降胆固醇情况结果见表2。

表2 降胆固醇菌株的初筛结果Table 2 Primary screening results of cholesterol-reducing strains

从表2可见，X2菌株随着培养时间的增加，颜色明显变浅，说明胆固醇降解能力强。X1菌株培养4 d时颜色略有变浅，但随着时间的延长颜色略有增加，这可能是X1菌株大量产生紫红色色素增加了培养液的颜色，它降胆固醇能力较弱。

2.4 不同发酵方式对X2菌株降胆固醇的影响

将两组装有30 mL发酵培养基的100 mL三角瓶，分别接入3 mL种子液，其中一组三角瓶在32 ℃静态培养6 d，另一组在32 ℃、180 r/min摇床培养6 d，通过皂化比色法测定其胆固醇含量，计算出胆固醇降解率，其结果见表3。

表3 不同发酵方式对胆固醇降解率的影响Table 3 Effect of different fermentation modes on degradation rate of cholesterols

由表3可知，在相同的发酵时间里，摇床发酵的发酵液中的胆固醇浓度较低，说明红曲霉在氧气充足情况下，降解胆固醇能力强，所以摇床培养有利于胆固醇的降解。

2.5 发酵时间对X2菌株胆固醇降解率的影响

在100 mL三角瓶中装入30 mL发酵培养基，接种3 mL种子液后于32 ℃、180 r/min摇床培养，考察发酵时间对胆固醇降解率的影响。红曲霉X2菌株降解胆固醇随时间的变化情况见表4。

从表4可见，在发酵的前4 d，随着发酵时间的增加，X2菌株对胆固醇降解率快速增加，其后降解率增加缓慢，在发酵至第6天时降解率高达60.82%，其后胆固醇含量无明显变化。另外，从胆固醇降解与红曲霉色素产生情况可知，红色素的产生与胆固醇的降解没有相关性，红色素的产生量也是随着该菌株培养时间的延长而增加。

表4 发酵时间对X2菌株胆固醇降解率的影响Table 4 Effect of fermentation time on degradation rate of cholesterols by strain X2

3 结论

本试验采用红方豆腐乳为菌源材料，分离纯化得到两株红曲霉菌株X1和X2。对菌株的生长及形态结构特征进行了观察，两株红曲霉在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，后变为淡粉色，最后变为红色和紫红色，菌落多褶皱，具有辐射纹。显微镜观察，两株菌菌丝均无横隔膜，随培养时间延长，菌丝壁加厚、变粗，并由菌丝形成分生孢子，孢子单生或成串生长，呈糖葫芦状，闭囊壳呈球形，有长短不一的柄。用含胆固醇麦汁培养基培养，通过铁矾显色剂显色初步确定，红曲霉菌株X2有显著的胆固醇降解能力，而菌株X1则不明显。不同发酵方式试验表明，摇床培养有利于降解胆固醇。用发酵培养基对X2菌株进行降胆固醇试验可知，在100 mL三角瓶中装入30 mL发酵培养基，接种3 mL种子液，32 ℃、180 r/min摇床培养6 d，胆固醇降解率可达60.82%。本试验筛选得到的红曲霉菌株X2具有较强的胆固醇降解能力，为其在食品领域有效利用提供了理论依据。

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