黄义山蔡燕易成凤严成燕苏忠龙廖涛陈金文赵明才熊元

四川北部地区肠杆菌科细菌产ESBLs CTX-M亚型研究

黄义山1蔡燕1易成凤2严成燕2苏忠龙1廖涛1陈金文1赵明才1熊元1

【摘要】目的 了解川北地区临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产超广谱β-内酰胺酶( ESBLs）CTX-M型亚型的分布情况。方法 选取CTX-M型的42株大肠埃希菌和14株肺炎克雷伯菌作为研究对象，对PCR扩增CTX-M耐药基因阳性者行DNA测序，测序结果在Genebank中进行比对。结果 42株大肠埃希菌中有30株出现CTX-M基因阳性条带，6株弱阳性；14株肺炎克雷伯菌，5株出现CTX-M阳性条带，2株弱阳性。ESBLs分子表型流行以CTX-M-14型为主，其次为CTX-M-3型,且发现1株OXY-2型；VITEK AES耐药表型判断的准确性达76.8%。结论 川北地区ESBLs分子表型中CTX-M-14型流行情况严重，应进一步加强消毒隔离措施和流行菌株的控制。

【关键词】超广谱β-内酰胺酶；CTX-M基因型；大肠埃希菌；肺炎克雷伯菌

作者单位：1 637000四川，川北医学院附属医院检验科；2 637000四川，川北医学院检验系

南充市科学技术和知识产权局，项目基金号：14A0049

近年来，在第三代（超广谱）头孢菌素选择性压力下，产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的菌株不断增加，这些菌株表现出多重耐药性，最常见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。我国由于头孢噻肟和头孢曲松的大量使用，临床分离到的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌往往表现为对头孢噻肟耐药而对头孢他啶敏感的不典型的超广谱β-内酰胺酶，主要为CTX-M型和SHV型[1]，而CTX-M型又有多种亚型。为了解川北地区CTX-M亚型的分布情况，对我院临床分离得到的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产CTM-X型ESBL进行基因型检测，以了解其流行分布情况。

1　资料与方法

1.1菌株来源

收集2012年1月～2012年6月我院住院及门诊感染患者送检的痰、中段尿、胸腹水和各种创面分泌物中分离出，经Vitek-32仪器鉴定为CTX-M型的大肠埃希菌42株和肺炎克雷伯菌14株,按照《全国临床检验操作规程》第2版常规培养分离并于-70℃冰箱保存菌株.

1.2方法

将冻存的菌株复苏后，制作细菌DNA模板。根据参考文献引物[2]进行PCR扩增。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后Bio．Rad凝胶成像仪检测。每组选取一株CTX-M基因扩增产物送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果在Genebank经比对确定其基因型。

2　结果

2.1CTX-M PCR扩增结果

42株大肠埃希菌经仪器检测可疑产ESBLs的菌株经CTX-M特异性引物扩增后，有30株扩增出阳性条带，6株弱阳性；14株肺炎克雷伯菌，5株扩增出阳性条带，2株弱阳性，所有结果均重复试验，两次结果均无明显差异。见图1。

图1 部分CTX-M型阳性PCR产物电泳图

M：Marker 2 000，泳道1-16为部分菌株CTX-M引物扩增结果，其中泳道2、14、16为弱阳性，其余在544 bp左右出现的条带均为CTX-M型阳性。

2.2ERIC-PCR扩增结果

图2 部分菌株ERIC-PCR电泳图

表1 CTX-M基因的两种PCR扩增方法比较（株）

根据条带位置完全一致判断为同一克隆株[3]，5株肺炎克雷伯菌属于独立基因型；30株大肠埃希菌分为20个组，15株属独立基因型,共25组，部分电泳图左边6株为肺炎克雷伯菌，右边11株为大肠埃希菌。见图2。

2.3CTX-M基因型测序结果

PCR扩增CTX-M基因，经方法1扩增出的基因产物，25株有9株测序成功；于是采用方法2，11株扩增成功的产物有10株测序成功。其扩增过程中各阶段的温度和反应时间以及循环次数均与方法1相同。见表1。

用两种方法共测序成功19株,测序结果在Genebank经DNA ssist 1.02比对，结果显示共有3种序列，其中16株（包括13株大肠埃希菌和3株肺炎克雷伯菌）序列与CTX-M-14、125、65、24、104、90、130比对一致，2株（两种细菌各占1株）序列与CTX-M-3、136、22、116、15、32比对一致，1株肺炎克雷伯菌序列与OXY-2比对一致。

3　讨论

我国CTX-M检出率在许多地方均较高，本实验将实验室经Vitek-32微生物分析仪检测提示为CTX-M型的42株大肠埃希菌和14株肺炎克雷伯菌用CTX-M基因特定引物扩增，大肠埃希菌有30株出现CTX-M基因阳性条带，6株弱阳性；肺炎克雷伯菌有5株出现CTX-M阳性条带，2株弱阳性，总体阳性扩增率为76.8%。

CTX-M PCR采用方法1扩增后，条带之间强弱有明显差异，重复扩增，条带强弱并无明显改变，3株强度较弱的条带最终测序也失败；采用方法2行CTX-M PCR扩增后，条带强度较一致，且较明显，但方法1中呈弱阳性的用方法2扩增后却为阴性，由此可见，该基因PCR扩增条件除与温度和时间等可控因素有关外，或许还与地域环境等其它未知因素有关。

根据近两年各个地方分析的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs基因型可知，我们国家以CTX-M-14型最为常见，本实验将CTX-M基因扩增成功的菌株采用ERIC-PCR初步将30株大肠埃希菌分为20个基因型，5株肺炎克雷伯菌各为一型。每型选取一株CTX-M PCR产物测序，最终结果显示，川北地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌主要以CTX-M-14型为主，其次为CTX-M-3型，值得一提的是本次实验发现1株肺炎克雷伯菌序列与OXY-2比对一致。而各种亚型间耐药性是否存在差异将在下一步实验中进一步分析比较。

参考文献

[1] 陈贤云，夏春，薛莲． 产超广谱B-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布及耐药性分析[J]． 国际检验医学杂志，2011，32（20）：2397-2398．

[2] 张玲，曹银元. 大肠埃希菌临床分离株CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因型研究[J].中国微生态学杂志，2009，21（9）：836-837.

[3] 陈定强，彭玉婷，罗毓婷，等. 多重耐药菌中β-内酰胺酶的基因型研究[J]. 检验医学与临床，2013，10（1）：1-3.

Study on Sichuan North Area Enterobacteriaceae Bacteria subType
of Produce ESBLs CTX-M

HUANG Yishan1CAI Yan1YI Chengfeng2YAN Chengyan2SU Zhonglong1LIAO Tao1CHEN Jinwen1ZHAO Mingcai1XIONG Yuan21 North Sichuan Medical College Affiliated Hospital Laboratory Department in Sichuan Province, Sichuan 637000, China 2 North Sichuan Medical College Test System in Sichuan Province, Sichuan 637000,China

[Abstract]Objective To investigate north area the clinical isolates of escherichia coli and klebsiella pneumoniae producing extended spectrum B- lactamases (ESBLs) distribution of CTX-M-type subtype. Methods Selected 42 CTX-M-type escherichia coli and 14 klebsiella pneumoniae as the research object, CTX-M-positive resistance gene was amplified by PCR for DNA sequencing, sequencing results were compared in the Genebank. Results 30 CTX-M gene positive bands appeared in 42 E.coli, 6 had weakly positive, 5 appear CTX-M positive bands in 14 klebsiella pneumoniae, 2 had weakly positive. ESBLs molecular phenotype popular with CTX-M-14 type, followed by the CTX-M-3 type, and found an OXY-2 type, VITEK AES resistant phenotype to determine the accuracy of up to 76.8%. Conclusion The North Region ESBLs molecular phenotype in CTX-M-14-type epidemic situation is serious, it should further strengthen disinfection and isolation measures and control of the epidemic strain.

[Key words]Extended-spectrum β-lactamase, CTX-Mgenotypes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.13.015

【文章编号】1674-9308（2015）13-0020-02

【文献标识码】B

【中图分类号】R181.3