杨林声，王理论，杜青卫

（延安大学附属医院眼科，陕西 延安 716000）

microRNA-215对人视网膜母细胞瘤细胞生长及抑癌基因Rb1表达的调控作用

杨林声，王理论，杜青卫

（延安大学附属医院眼科，陕西 延安 716000）

目的 研究microRNA-215(miR-215)在视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达及其临床意义，并探讨其对RB细胞活力、增殖及凋亡的影响。方法采用qRT-PCR检测51例RB患者及相应癌旁组织中miR-215的表达并分析其与患者临床病理特征的相关性。在RB细胞中转染miR-215类似物或miR-215抑制物，采用噻唑蓝比色法(MTT)、溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增殖分析、Caspase3活性检测及流式细胞仪检测细胞活力、增殖及凋亡的影响。Western blot检测视网膜母细胞瘤蛋白1(Rb1)表达变化。结果miR-215在RB组织中的表达水平显著高于对应的癌旁组织(P＜0.01)；miR-215表达与视神经浸润(P=0.002)及分化程度(P=0.041)有关；miR-215在RB细胞系Y79及HXO-Rb44中的表达水平显著高于其在正常视网膜血管内皮细胞ACBRI-181中的表达水平(P＜0.01)；miR-215抑制物显著降低HXO-Rb44细胞中miR-215的表达水平并导致细胞活力降低、增殖能力下降、胞内Caspase3活性增加及凋亡细胞百分比增加；miR-215类似物显著升高Y79细胞中miR-215的表达水平并导致细胞活力升高、增殖能力增强及凋亡细胞百分比降低。同时，下调HXO-Rb44细胞中miR-215水平显著升高细胞内Rb1蛋白表达水平，过表达Y79细胞中miR-215水平显著降低细胞内Rb1蛋白表达水平。结论miR-215在视网膜母细胞瘤组织中表达升高且与恶性临床病理特征相关。miR-215可增强视网膜母细胞瘤细胞活力、增殖能力并减少细胞凋亡，并可降低细胞内Rb1蛋白表达，提示miR-215在视网膜细胞瘤的发生发展中发挥重要作用。

MicroRNA-215；视网膜母细胞瘤；肿瘤生长；临床意义

视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma，RB)是发生于视网膜核层、具有家族倾向、多发于5岁以下婴幼儿的一种恶性肿瘤[1-2]。该肿瘤易发生颅内和远处转移，常危及患儿生命[3-4]。因此，寻找RB早期诊断的生物学标志物，探明其发生发展的分子信号机制并发现能有效抑制其发生发展的治疗靶点，对提高RB的诊治水平，改善患儿预后具有重要意义。在RB组织中，抑癌基因Rb1存在低表达，是导致RB发生的重要分子基础[3]。研究表明，Rb1在RB组织中的低表达可能与基金突变、表观遗传修饰等多种分子机制有关[5]。然而，RB组织及细胞中microRNA的异常表达是否会导致Rb1低表达，进而参与肿瘤的发生发展，目前仍不明确。

近年来的研究发现，microRNA-215(miR-215)在多种肿瘤组织中存在异常表达[6-8]，并在肿瘤增殖[6]、迁移及侵袭[7]等多种生物学功能中发挥重要功能。然而，miR-215在RB组织及细胞中的表达及生物学功能，以及其是否能够抑制Rb1蛋白的表达，目前尚不明确。本课题通过检测miR-215在视网膜母细胞瘤组织中的表达，分析其与RB患者临床病理特征的关系，并应用人工合成的miR-215的抑制物和类似物探明miR-215在RB发生发展中的生物学功能及其对Rb1的调控作用，为将miR-215确立为RB的新生物学标志物和治疗靶点理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集西安交通大学第一附属医院眼科2001年1月至2014年12月经病理诊断为RB并行手术摘除眼球患者51例。51例患者的就诊年龄为3个月至9岁，平均(3.2±1.9)岁；男性19例，女性32例；单眼20例，双眼31例；分化型14例，未分化型37例；发生神经浸润30例，未发生神经浸润21例。术前均未接受化疗及局部放疗等治疗。本研究获得所有患者监护人知情同意及医院的伦理学审核。

1.2 实验材料 RNA提取所用的TRIzol购自于美国Life Technologies公司；PrimeScript reverse transcription-PCR(RT-PCR)试剂盒购自Takara公司；TaqMan miRNA Reverse Transcription试剂盒及TaqMan Human MiRNA Assay试剂盒购自Applied Biosystems公司；人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181和视网膜母细胞瘤系Y79及HXO-Rb44购自于美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)；细胞培养所用的DMEM购自 Hyclone公司；细胞转染用的脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；MiRNA质粒包括miR-215表达质粒(miR-215 mimics)、miR-215抑制质粒(miR-215 inhibitor)及其相应的对照质粒购自Genecopoeia公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒及Caspase-3活性检测试剂盒购自凯基生物公司；兔抗人Rb1多克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Cell signaling公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量RT-PCR 根据TRIzol®操作说明书提取总RNA，应用RT-PCR试剂盒逆转录cDNA。使用TaqMan miRNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)和TaqMan Human MiRNA Assay试 剂 盒 (Applied Biosystems)定量检测miR-215表达。△△Ct法用于计算miR-215相对于U6的相对表达量。

1.3.2 细胞培养 人正常视网膜血管内皮细胞ACBRI-181和视网膜母细胞瘤Y79及HXO-Rb44培养于含10%胎牛血清(Gibco，USA)、1%青霉素/链霉素(Sigma，USA)的DMEM培养基(Gibco)中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，饱和湿度下培养。稳定传代2～3代后，取对数生长期细胞进行实验。

1.3.3 质粒构建和转染 使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将miRNA质粒包括miR-215表达质粒(miR-215 mimics)、miR-215抑制质粒(miR-215 inhibitor)及其相应的对照质粒转染视网膜母细胞瘤系细胞，并应用潮霉素筛选稳定表达细胞株用于进一步实验。

1.3.4 MTT法检测细胞活力 取对数生长期的细胞，用培养基制备细胞数为1×105/ml的单细胞悬液，以200 μl/孔接种于96孔板。接种细胞24 h、48 h、72 h后MTT检测细胞活力。在检测细胞活力前4 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT；孵育4 h后，吸出培养液，每孔加入DMSO 150 μl，于室温轻微溶解结晶15 min。每个时间点设6个复孔。酶标仪在490 nm波长处检测每孔的吸光值。

1.3.5 Brdu-ELISA法测定细胞增殖 取对数生长期细胞，用培养基制备细胞数为1×105/ml的单细胞悬液，以200 μl/孔接种于96孔板并进行细胞转染。培养结束前每孔加入20 μl BrdU标记液，继续培养6 h。ELISA法检测细胞增殖抑制：加BrdU培养结束后，加入Fix Denat使DNA变性，然后每孔加100 μl HRP标记的抗BrdU抗体，洗涤3次，每孔加入100 μl TMB底物液显色，20 min后加1 mol/L H2SO4终止反应，置振荡器上1 min，在酶标仪上以450 nm/630 nm双波长检测吸光值，即BrdU值。每组设3个副孔。

1.3.6 Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性 胰酶消化转染48 h后的细胞，800 r/min离心5 min弃掉胰酶。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，2 000 r/min离心5 min，收集(3～5)×106个细胞。在收集的沉淀细胞中加入50 μl预冷的Lysis Buffer，并置于冰上裂解20～30 min，期间涡旋震荡3～4次；随后，将上述裂解液于4℃离心机以10 000 r/min离心1 min。吸取裂解液上清至新的EP管中，并置于冰上备用；取少量上清液，并用BCA法测定其中的蛋白浓度。吸取50µl含有100～200 μg蛋白的细胞裂解上清，并加入50µl的2×Reaction buffer，使用前每50µl的2×Reaction buffer加入0.5µl DTT；随后加入5 μl Caspase-3 Substrate，并于37℃避光孵育4 h。利用酶标仪在405 nm波长处测定其吸光值。

1.3.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 取转染后48 h后的细胞，用0.01 mol/L PBS洗涤细胞，800 r/min离心5 min后弃去上清，用1×Binding buffer重悬细胞并调整细胞数为1×106/ml，每管加入500 ul细胞悬液、5µl Annexin V-FITC和10 μl PI。混匀室温避光孵育20 min后，进行流式细胞仪检测，每个样本独立重复3次。

1.3.8 Western blot利用RIPA试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(BCA kit)检测蛋白样品浓度。取40µg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离后，利用湿转仪将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入5%牛血清蛋白(BSA)稀释的Rb1多克隆抗体(1:1 000)及β-actin单克隆抗体(mAb，1:1 500)4℃孵育过夜后，加HRP标记二抗(1:10 000)，室温孵育2 h。最后利用ECL化学发光剂暗室显影。

1.4 统计学方法 使用SPPSS13.0和GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析。两组间计数资料比较采用χ2检验，计量资料以均数±标准误(±s)表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-215在RB组织及对应癌旁组织中的表达 应用qRT-PCR检测miR-215在51例骨肉瘤及对应癌旁组织中的表达，结果提示miR-215在视网膜母细胞瘤组织中的表达水平显著高于对应的癌旁组织[(1.170±0.255)vs(1.940±0.102)，t=2.800，P＜0.05]，见图1。

图1 miR-215在视网膜母细胞瘤及其对应瘤旁组织中的表达水平

2.2 miR-215表达水平与视网膜母细胞瘤患者临床病例特征的相关性 将miR-215在视网膜母细胞瘤组织中的表达水平的中位值定为界值，miR-215表达水平低于中位值者归为miR-215低表达组，miR-215表达水平等于或高于中位值的患者归为miR-215高表达组。miR-215表达与视网膜母细胞瘤患者临床病理特征之间的相关性详见表1，结果显示骨肉瘤组织中miR-215表达与视神经浸润(χ2= 9.206，P=0.002)及分化程度(χ2=3.878，P=0.041)有显著相关性。

表1 miR-215表达与RB患者临床病理特征的关系（n=51）

2.3 miR-215在人视网膜母细胞瘤细胞中的表达水平 采用qRT-PCR检测视网膜母细胞瘤细胞系Y79、HXO-Rb44和人正常视网膜血管内皮细胞ACBRI-181细胞中miR-215的表达。检测结果表明：miR-215在Y79及HXO-Rb44中的表达水平显著高于其在ACBRI-181细胞中的表达[(0.977±0.065)vs (1.770±0.047)，t=9.882，P＜0.01；(0.977±0.065)vs (2.510±0.102)，t=12.670，P＜0.01]，见图2。

图2 miR-215在人视网膜母细胞瘤细胞系及正常视网膜血管内皮细胞中的表达水平

2.4 下调miR-215导致HXO-Rb44细胞活力及增殖能力减弱，凋亡增加 为进一步研究miR-215在视网膜母细胞瘤中的生物学功能，将miR-215抑制物转染HXO-Rb44细胞，进而检测细胞活力、增殖能力及凋亡的变化。qRT-PCR检测结果显示：与对照组比较，miR-215抑制物能够显著下调HXO-Rb44细胞中miR-215的表达(P＜0.01，图3A)。MTT实验结果表明：下调miR-215的表达后，HXO-Rb44细胞活力显著下降(P＜0.01，图3B)；BrdU细胞增殖分析检测细胞增殖能力变化显示：下调miR-215导致HXO-Rb44细胞增殖能力显著减弱(P＜0.05，图3C)；另一方面，Caspase-3活性检测表明：下调miR-215的表达后，细胞内Caspase-3活性显著增加(P＜0.01，图3D)；同时，流式细胞仪检测细胞凋亡显示：下调miR-215表达后，HXO-Rb44细胞的凋亡比例显著增加(P＜0.01，图3E)。

图3 下调miR-215对HXO-Rb44细胞活力、增殖能力及凋亡的影响

2.5 上调miR-215导致Y79细胞活力及增殖能力增强，凋亡减少 为进一步证实miR-215调控细胞活力、增殖及凋亡的影响，进一步利用miR-215类似物转染Y79细胞，进而检测检测细胞活力、增殖能力及凋亡的变化。qRT-PCR检测结果显示：与对照组相比，miR-215类似物转染能够显著升高上调Y79细胞内miR-215的表达水平(P＜0.01，图4A)；功能学实验进一步表明：上调miR-215表达后，MTT结果显示Y79细胞活力显著增强(P＜0.05，图4B)，BrdU细胞增殖分析表明细胞增殖能力显著增强(P＜0.01，图4C)， Caspase-3活性检测提示细胞内Caspase-3活性显著降低(P＜0.05，图4D)，同时流式细胞仪检测结果提示凋亡细胞比例显著降低(P＜0.05，图4E)。

2.6 miR-215调控视网膜母细胞瘤细胞中Rb1蛋白的表达RB1是重要的抑癌基因，Rb1蛋白低表达是视网膜母细胞瘤的重要特征，Rb信号调节途径是一种主要的抑癌方式，在抑制细胞增生方面具有重要的作用。为探明miR-215能否下调HXO-Rb44细胞中Rb1蛋白表达进而发挥促进视网膜母细胞瘤发生发展的作用，进一步利用Western blot法检测下调miR-215后HXO-Rb44细胞中Rb1蛋白的表达水平。检测结果表明：下调miR-215表达后，细胞内Rb1蛋白的表达显著增加(P＜0.01，图5A)。另一方面，miR-215 mimics转染后Y79细胞后，细胞内Rb1蛋白的表达显著降低(P＜0.01，图5B)。

图4 过表达miR-215对Y79细胞活力、增殖能力及凋亡的影响

图5 MiR-215对视网膜母细胞瘤细胞中Rb1蛋白的表达变化

3 讨论

MiRNAs是细胞内一组长度较短的(约22个核苷酸)内源性非编码RNA[9]，可通过与靶mRNAs的3'端非编码区域的识别序列部分互补结合，最终导致mRNAs降解或翻译受阻。越来越多的证据表明：miRNAs在多种细胞进程中发挥决定性作用[10-11]，如分化、形态发生和肿瘤发生。在人类肿瘤发生中，miRNAs可发挥促癌或者抑癌的生物学功能，并可作为肿瘤早期诊断及预后评估的有效生物学标志物[12]。本研究表明：相较于正常癌旁组织，miR-215在视网膜母细胞瘤组织中存在显著高表达；同时，miR-215的异常高表达与患者的不良病理特征存在显著相关性。这表明：miR-215可能作为视网膜母细胞瘤患者早期诊断及预后评估的潜在生物学标志物。

增殖能力增强及凋亡减少是肿瘤细胞的重要生物学特征，也是肿瘤发生进展的重要生物学基础[13]。本研究的功能学实验结果表明：上调miR-215后，视网膜母细胞瘤细胞的增殖能力显著增强而凋亡显著减少；下调miR-215后，其增殖能力显著减弱而凋亡显著增加。因此，这些研究结果表明：miR-215可以通过增强细胞增殖能力，减少细胞凋亡，进而发挥促进视网膜母细胞瘤发生发展的生物学功能。

在哺乳动物体内，抑癌基因RB缺失、突变及表达减少在多种肿瘤的发生发展中具有重要作用[5]，如视网膜母细胞瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌及乳腺癌等。同时，大量研究表明miRNAs表达或功能异常是肿瘤发生发展的重要原因[9-10]。miRNAs可通过下调肿瘤内抑癌基因的表达或上调促癌基因的表达而促进肿瘤的发生发展。在胃癌中的研究表明，miR-215能够下调胃癌组织中Rb1蛋白的表达，进而发挥增强胃癌细胞增殖的作用[6]。本研究的实验数据表明：上调miR-215后，视网膜母细胞瘤细胞中Rb1蛋白的表达显著降低，而下调miR-215后，细胞内Rb1蛋白表达显著增高。这提示miR-215能够通过抑制细胞内Rb1蛋白的表达而发挥促进视网膜母细胞瘤发生发展的作用。

总之，本研究证实：在视网膜母细胞瘤组织中miR-215表达显著增加且与患者不良临床病理特征相关；miR-215可发挥促进视网膜母细胞瘤细胞增殖能力及抑制其凋亡的能力；同时，miR-215能够显著抑制细胞内Rb1蛋白的表达。本研究结果表明miR-215有望成为视网膜母细胞瘤早期诊断和预后评估的标志物，并可能成为视网膜细胞瘤基因治疗的潜在靶点。

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Regulatory effect of MicroRNA-215 on the growth of human retinoblastoma cells and the expression of Rb1.

YANG Lin-sheng,WANG Li-lun,DU Qing-wei.Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Yan'an University,Yan'an 716000,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical significance and functional role of microRNA-215 (miR-215)in retinoblastoma(RB)tissues and cells,and to analyze the effect of miR-215 on cell viability,proliferation and apoptosis.MethodsWe detected miR-215 expression in 51 samples of RB and the matched normal tumor-adjacent tissues using qRT-PCR.The expression level of miR-215 was altered by corresponding vectors(miR-215 inhibitor and miR-215 mimic)in RB cells.And then MTT,BrdU cell proliferation,Caspase3 activity and flow cytometry assay were performed to examine the viability,proliferation and apoptosis of RB cells.Western blot was used to detect thealteration of Rb1 expression after the over-expression or down-expression of miR-215.ResultsThe expression level of miR-215 in RB tissues was significantly higher than that in normal tumor-adjacent tissues(P＜0.01).The expression of miR-215 in tumor tissues was significantly associated with optic nerve infiltration(P=0.002)and differentiated degree(P=0.041).The expression levels of miR-215 in RB cell lines Y79 and HXO-Rb44 were significantly higher than that in retinal microvascular endothelial cells ACBRI-181(P＜0.01).MiR-215 expression was significantly inhibited by miR-215 inhibitor in HXO-Rb44 cells,and down-expression resulted in significantly decreased cell viability and proliferation,as well as increased apoptosis.On the contrast,MiR-215 expression was significantly improved by miR-215 mimic in Y79 cells,and the over-expression led to significantly increased cell viability and proliferation,as well as decreased apoptosis.Besides,the down-expression of miR-215 in HXO-Rb44 cells significantly increased the level of Rb1,while the over-expression of miR-215 in Y79 cells significantly decreased the level of Rb1.ConclusionIncreased expression of miR-215 is correlated with the adverse clinicopathological features of retinoblastoma.MiR-215 may regulate cell viability,proliferation and apoptosis of retinoblastoma cells by targeting Rb1, suggesting miR-215 may play a key role in the development and progression of retinoblastoma.

MicroRNA-215;Retinoblastoma;Tumor growth;Clinical significance

R739.7

A

1003—6350（2015）24—3592—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.24.1300

2015-07-26)

陕西省科技厅项目（编号：2013KJXX31）

王理论。E-mail：yanglinsheng783@163.com