牟忠卿，李晓博，陈丽

(1卫生部北京医院，北京 100730；2 山东大学第二医院；3山东大学齐鲁医院)

·基础研究·

糖尿病大鼠肝脏组织中氧化应激标志物的表达变化及意义

牟忠卿1，李晓博2，陈丽3

(1卫生部北京医院，北京 100730；2 山东大学第二医院；3山东大学齐鲁医院)

摘要：目的观察糖尿病大鼠肝脏组织中氧化应激标志物的表达变化，并探讨其意义。方法36只Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病维持组(DM组)、糖尿病治疗组(DT组)。DM组、DT组按60 mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素进行造模，NC组注射等量柠檬酸缓冲液。造模成功后，DM组大鼠皮下注射鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)2～4 U/2 d，DT组皮下注射PZI 9～12 U/(kg·d)，NC组则注射等量的生理盐水。12周后，检查各组大鼠体质量、血糖、血脂、肝功能，比色法测定各组大鼠肝脏组织中总超氧化物歧化酶(TSOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(TAOC)、丙二醛(MDA)，并对各组大鼠肝脏组织进行HE、PAS染色和硝基酪氨酸(NT)免疫组化染色。结果12周后，与NC组、DT组相比，DM组大鼠TC、TG、ALT、AST水平增高，大鼠肝脏组织MDA水平、TAOC、TSOD活性、CAT活性、GSH-Px活性增高(P均<0.05)。DM组大鼠肝脏组织存在脂肪变性，PAS阳性的糖原颗粒少且分布不均匀，而在DT组中这些病变明显改善。NT在DM组的表达较NC组、DT组强(P均<0.05)。结论糖尿病大鼠肝脏组织中氧化应激增强，治疗后减轻，氧化应激可能是导致大鼠肝脏组织受损的机制之一。

关键词：糖尿病；肝损伤；氧化应激；抗氧化酶

糖尿病慢性并发症不仅包括肾脏、心肌、视网膜、神经病变，肝脏亦为长期高血糖的靶器官之一[1,2]。同时，肝脏又对糖尿病和高血糖有重要影响，肝脏通过糖原的合成与分解来调节葡萄糖代谢，影响血糖水平。此外，肝脏在体内氧化和抗氧化作用中均起重要作用[3]，肝脏具有丰富的抗氧化酶类及抗氧化物质，通过氧化还原反应影响营养物质、药物代谢，而氧化应激在糖尿病长期慢性并发症中起着关键作用。本研究观察了糖尿病大鼠肝脏组织中氧化应激标志物的表达变化，并探讨其意义。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂健康雄性Wistar大鼠36只，体质量200～250 g，购于山东大学动物实验中心。链脲佐菌素(STZ)柠檬酸溶液购于Sigma公司；各种抗氧化酶活性、总抗氧化能力(TAOC)、丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；HITACH U-2000分光光度计购于日立公司；硝基酪氨酸(NT)免疫组化试剂盒购于Cayman公司；HPIAS-1000生物医学图像分析系统购于华中科技大学；DCA2000购于德国拜耳公司。

1.2动物分组及处理将大鼠随机分为正常对照组(NC组，10只)、糖尿病维持组(DM组，14只)、糖尿病治疗组(DT组，12只)。DM组、DT组大鼠按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ柠檬酸溶液，72 h后尾静脉全血血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型造模成功；NC组则注射等量柠檬酸缓冲液。造模成功后，DM组皮下注射鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)2～4 U/2 d，而DT组皮下注射PZI 9～12 U/(kg·d)，NC组则注射等量的生理盐水。

1.3观察方法大鼠每周称体质量，喂养12周后处死，迅速心脏穿刺取血，采用自动生化分析仪测定血糖、TC、TG、ALT、AST等，采用DCA2000仪器测定糖化血红蛋白(HbA1c)。取大鼠的肝脏，称重。取大鼠肝脏组织0.1 g，制成10%匀浆液，保存于-20 ℃冰箱中。采用HITACH U-2000分光光度计用比色法测定各组大鼠肝脏组织中总超氧化物歧化酶(TSOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性以及TAOC、MDA水平。取部分肝脏组织固定于10%的甲醛溶液中，对肝脏组织进行HE染色、PAS染色，并采用Cayman公司小鼠抗大鼠NT单克隆抗体行肝脏组织NT免疫组化染色，用HPIAS-1000生物医学图像分析系统测试光密度(OD)进行分析。

2结果

各组大鼠体质量、血糖、血脂水平比较见表1，肝脏质量、肝脏功能水平比较见表2，抗氧化酶活性、TAOC及MDA水平比较见表3。HE染色可见，NC组肝小叶结构正常，肝细胞索清晰，肝细胞排列整齐、规则，肝细胞胞质嗜酸性，核圆居中，染色质疏松，核膜和核仁清楚，肝细胞无变性；DM组肝组织结构紊乱，肝细胞混浊肿胀，肝窦变宽，部分肝细胞脂肪滴明显增多，为轻度脂肪变性；DT组肝脏组织结构较DM组结构整齐，细胞脂肪变性减轻，无明显的炎性细胞浸润。PAS染色可见，NC组中肝细胞胞浆内红色糖原颗粒较多，分布相对较均匀；DM组肝细胞胞质中红色糖原颗粒明显减少，并且分布极不均匀，脂肪变性多见；DT组肝细胞内PAS阳性颗粒较DM组明显增多，分布较均匀。肝脏组织中NT染色见于细胞的胞质中。NC组、DM组、DT组肝脏组织NT免疫组化的OD值分别为0.067 4±0.005 3、0.117 1±0.006 2、0.069 7±0.006 2，DM组与NC组、DT组比较，P均<0.05。NC组、DM组、DT组肝脏NT阳性细胞百分数分别为21.37%±5.00%、78.62%±16.00%、25.19%±7.00%，DM组与NC组、DT组比较，P均<0.05。

注：与同组0周时体质量比较，*P<0.05；与NC组比较，#P<0.05；与DT组比较，△P<0.05。

注：与NC组比较，#P<0.05；与DT组比较，△P<0.05。

注：与NC组比较，#P<0.05；与DT组比较，△P<0.05。

3讨论

综上可见，糖尿病大鼠肝脏组织中氧化应激增强，一些新药物在降低血糖的同时，还能够改善氧化应激水平和肝功能[8,13,14]，这加深了我们对糖尿病与氧化应激之间关系的理解，也为糖尿病肝损伤及其他并发症的治疗提供了新的方向与途径。

参考文献：

[1] Herzig S. Liver: a target of late diabetic complications[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2012,120(4):202-204.

[2] Hao J, Shen W, Sun L, et al. Mitochondrial dysfunction in the liver of type 2 diabetic Goto-Kakizaki rats: Improvement by a combination of nutrients[J]. Br J Nutr, 2011,106(5):648-655.

[3] Stadler K, Jenei V, von Bolcshazy G, et al. Increased nitric oxide levels as an early sign of premature aging in diabetes[J]. Free Rad Biol, 2003,35(10):1240-1251.

[4] Goodarzi MT, Navidi AA, Rezaei M, et al. Oxidative damage to DNA and lipids: Correlation with protein glycation in patients with type 1 diabetes[J]. J Clin Lab Anal, 2010,24(2):72-76.

[5] 王健,耿跃春,刘少辉,等.氧化应激对大鼠糖代谢影响的实验研究[J].中华全科医学杂志,2010,8(6)：673-678.

[6] Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J]. Nature, 2001,(414):813-820.

[7] Lee SY, Lee JY, Oh SJ,et al. Expression of hepatic and ovarian antioxidant enzymes during Estrous cycle in rats[J]. Toxicol Lett, 2012,212(3):329-236.

[8] Prasath GS, Subramanian SP. Fisetin, a tetra hydroxy flavone recuperates antioxidant status and protects hepatocellular ultrastructure from hyperglycemia mediated oxidative stress in streptozotocin induced experimental diabetes in rats[J]. Food Chem Toxicol, 2013,(59):249-255.

[9] Ryu CS, Oh SJ, Oh JM,et al. Expression of hepatic antioxidant enzymes in non-obese type-2 diabetic Goto-Kakizaki rats[J]. Arch Pharm Res, 2014,37(10):1345-1353.

[10] Trivedi S, Lal N, Mahdi AA, et al. Evaluation of antioxidant enzymes activity and malondialdehyde levels in patients with chronic periodontitis and diabetes mellitus[J]. J Periodontol, 2014,85(5):713-720.

[11] Aliciguzel Y, Ozen I, Aslan M, et al. Activities of xanthine oxidoreductase and antioxidant enzymes in different tissues of diabetic rats[J]. J Lab Clin Med, 2003,(142):172-177.

[12] Rajendran P, Nandakumar N, Rengarajan T, et al. Antioxidants and human diseases[J]. Clin Chim Acta, 2014,(436):332-347.

[13] Tahara A, Kurosaki E, Yokono M, et al. Effects of SGLT2 selective inhibitor ipragliflozin on hyperglycemia, hyperlipidemia, hepatic steatosis, oxidative stress, inflammation, and obesity in type 2 diabetic mice[J]. Eur J Pharmacol, 2013,715(1-3):246-255.

[14] Nicolle E, Souard F, Faure P, et al. Flavonoids as promising lead compounds in type 2 diabetes mellitus: molecules of interest and structureactivity relationship[J]. Curr Med Chem, 2011,18(17):2661-2672.

(收稿日期：2014-06-24)

中图分类号：R589.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)07-0026-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.009