邵力伟，姚春，伍龙，任德发(江汉大学附属第二医院、武汉市第五医院，武汉430050)

环巴胺抑制Shh信号对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

邵力伟，姚春，伍龙，任德发
(江汉大学附属第二医院、武汉市第五医院，武汉430050)

摘要:目的探讨环巴胺靶向抑制Shh信号对乳腺癌细胞增殖、凋亡以及Survivin表达的影响。方法采用荧光定量PCR法检测乳腺癌组织及癌旁正常组织中Shh、PTCH1及GLi1的表达，MTT法检测不同浓度环巴胺对人乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制的影响，流式细胞术检测环巴胺对MCF-7细胞凋亡的影响，Western blot检测环巴胺处理前后MCF-7细胞GLi1和Survivin的表达。结果Shh、PTCH1及GLi1在乳腺癌组织中均呈高表达;不同浓度环巴胺均可抑制MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡;环巴胺处理后GLi1和Survivin的表达均降低。结论Shh信号在乳腺癌组织中呈激活状态，靶向抑制Shh信号可抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，其可能通过抑制Survivin表达发挥作用。

关键词:乳腺癌; Shh信号;环巴胺;细胞增殖;细胞凋亡; Survivin蛋白

研究显示，Shh信号在多种恶性肿瘤中异常激活并与肿瘤的恶性程度密切相关，针对Shh信号通路的靶向治疗有望成为治疗恶性肿瘤的新途径［1～3］。凋亡抑制蛋白Survivin是抑制细胞凋亡的重要成分之一，抑制肿瘤细胞中Survivin的表达可起到抑制增殖、促进凋亡的作用［4］。本研究通过检测乳腺癌细胞中Shh信号分子(Shh、PTCH1、GLi1)的表达情况，进一步利用Shh信号通路特异性抑制剂环巴胺作用于人乳腺癌细胞系MCF-7，观察其对乳腺癌细胞增殖、凋亡及Survivin表达的影响。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2008年1月～2012年12月我院收治的乳腺癌手术患者46例，年龄30～69 (42.8±3.1)岁。术前均未接受放化疗，术后经病理检查确诊。其中浸润性导管癌39例、其他7例。TNM分期Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期31例，Ⅳ期5例。术中分别取肿瘤组织和癌旁正常乳腺组织迅速冷冻于液氮，－80℃保存备用。

1.2细胞与试剂人乳腺癌细胞系MCF-7(由武汉大学人民医院中心实验室自行传代培养)培养于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中常规传代培养。SYBR Premix EX Taq试剂盒购自Invitrogen公司; RPMI1640培养基、胎牛血清、Trizol试剂为美国Gibco公司产品;环巴胺、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰酶等为美国Sigma公司产品;一抗GLi1、Survivin、GAPDH兔抗人单克隆抗体均购自Cell signaling公司;二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3检测方法

1.3.1Shh信号相关蛋白检测采用实时荧光定量PCR方法。取乳腺癌组织和癌旁正常组织，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，以其为模板进行逆转录，合成cDNA第一链，－20℃保存备用。按照SYBR试剂盒说明书操作。Shh上游引物: 5'-CCCAATTACAACCCCGACATC-3';下游引物: 5'-TCACCCGCAGTTTCACTCCT-3'。PTCH1上游引物: 5'-TGAGACTGACCACGGCCTG-3';下游引物: 5'-ACCCTCAGTTGGAGCTGCTTC-3'。GLi1上游引物: 5'-GTGCAAGTCAAGCCAGAACA-3';下游引物: 5'-ATAGGGGCCTGACTGGAGAT-3'。内参GAPDH上游引物: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3';下游引物: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.2细胞增殖检测采用MTT法。将MCF-7以5×104/mL接种于96孔板中，每孔200 μL。在37℃、饱和湿度、含5% CO2的培养箱中培养24 h后换液。分别加入5、10、20 μmol/L环巴胺，未处理细胞作为对照，每组设3个复孔。继续培养24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，继续孵育4h。更换培养液为150 μL的DMSO，震荡混匀，用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度值。细胞生长抑制率(%)=(对照组吸光度－实验组吸光度)/对照组吸光度×100%。重复实验3次取平均值。

1.3.3细胞凋亡检测将MCF-7消化重悬后，以2 ×105/孔接种于6孔板中，分别加入5、10、20 μmol/L环巴胺，未处理细胞作为对照，每组设3个复孔，继续培养48 h。常规胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，加入Annexin V-FITC和PI避光室温孵育15 min，上流式细胞仪检测。实验重复3次取平均值。

1.3.4Survivin蛋白检测采用Western blot法。收集0、5、10、20 μmol/L环巴胺处理48 h后的MCF-7细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度。取20 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳并转移至PVDF膜。常规封闭、洗膜后加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，加入二抗室温孵育2 h，化学发光显色。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件，计量资料采用珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学差异。

2　结果

2.1Shh信号在肿瘤组织与癌旁组织中的表达肿瘤组织中Shh、PTCH1和GLi1的表达均显著高于癌旁组织(P均＜0.01)。见表1。

表1　Shh信号相关蛋白在乳腺癌中的表达(n=3，相对表达量，±s)

注:与肿瘤组织比较，*P＜0.01。

检测部位Shh　PTCH1　GLI1肿瘤组织0.473±0.324　0.36±0.209　0.296±0.106癌旁组织　1.558±0.431*　0.99±0.202*　2.105±0.700*

2.2不同浓度环巴胺对MCF-7增殖的影响MTT实验结果显示，5、10、20 μmol/L环巴胺均可抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖，其抑制作用具有时间和剂量依赖性。见表2。

表2　不同浓度环巴胺对MCF-7增殖抑制率的影响(n=3，%，±s)

组别　MCF-7增殖抑制率24 h　48 h　72 h对照组0.14±0.59　1.58±0.83　3.71±3.34环巴胺组5 μmol/L　8.73±0.45　10.47±0.70　13.17±0.45 10 μmol/L　18.90±2.95　27.07±4.05　33.20±2.75 20 μmol/L　29.40±6.26　37.83±3.23　38.57±4.52 F 39.942　116.378　82.495 P 0.000　0.000　0.000

2.3不同浓度环巴胺对MCF-7凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，0、5、10、20 μmol/L环巴胺均可诱导MCF-7细胞凋亡，其凋亡率分别为(1.94± 0.64) %、(11.09±1.65) %、(26.87±0.97) %、(32.56±2.67) %，随环巴胺浓度增加，凋亡率明显增加(P＜0.01)。

2.4不同浓度环巴胺对Survivin蛋白表达的影响

Western blot结果显示，不同浓度环巴胺均可降低GLi1和Survivin的表达，其作用随浓度增加而增强。见图1。

3　讨论

研究显示，多种信号转导途径在乳腺癌中呈激活状态，靶向抑制这些信号通路可能成为一种新的治疗乳腺癌的手段［5］。Shh信号通路在调控胚胎发育和干细胞分化中具有重要作用，其异常激活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。Shh信号通路的关键因子包括Shh、PTCH、GLi等，在Hh信号激活时，Hh与PTCH(PTCH1、PTCH2)结合，进一步将信号传递给转录因子GLi(GLi1、GLi2、GLi3)，后者进入核内，促进基因表达，参与对细胞增殖与凋亡的调控过程。研究表明，在肝癌、胃癌、骨肉瘤、乳腺癌［6］等恶性肿瘤中均存在Shh信号的异常激活。本研究显示，乳腺癌组织及癌旁正常组织中Shh信号分子Shh、PTCH1和GLi1均呈高表达，与文献［7～9］报道相符。

本研究使用Shh信号通路的特异性抑制剂环巴胺体外作用于乳腺癌细胞，观察不同浓度环巴胺对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，不同浓度环巴胺均可抑制Shh信号关键分子GLi1的表达，且可抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导其发生凋亡。提示体外靶向抑制Shh信号通路可抑制乳腺癌细胞的生长，有望对乳腺癌起到治疗作用。

Shh信号激活后可通过作用于多种效应分子来调控肿瘤细胞的增殖与凋亡［10］。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，其在恶性肿瘤中常呈高表达而起到促进增殖和抑制凋亡的作用，采用各种手段抑制肿瘤细胞中Survivin的表达可起到抑制肿瘤生长的作用［11］。本研究显示，应用环巴胺抑制Shh信号后，乳腺癌细胞MCF-7中Survivin的表达显著降低，提示环巴胺靶向抑制Shh可能是通过抑制Survivin的表达而对乳腺癌细胞起到杀伤作用。

综上所述，Shh信号在乳腺癌的发生、发展中起重要作用。应用Shh信号通路特异性抑制剂环巴胺靶向抑制Shh信号可有效抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡，其可能是通过抑制Survivin的表达发挥作用。

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(收稿日期:2014-12-31)

文章编号:1002-266X(2015) 18-0058-03

文献标志码:B

中图分类号:R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.021