刘伟，李代红，王凯，刘纯(天津市第一中心医院，天津300192)

刘伟，李代红，王凯，刘纯
(天津市第一中心医院，天津300192)

摘要:目的探讨肝移植术后患者外周血T淋巴细胞内ATP水平和T细胞亚群联合检测对免疫功能的监测作用。方法选择肝移植术后患者80例，其中术后病情稳定30例(稳定组)、出现感染30例(感染组)，发生急性排异反应20例(排异组)，另选健康体检者30例作为对照组。采用Cylex+ ImmuKnow方法检测T淋巴细胞内ATP，流式细胞术检测T细胞亚群，比较各组ATP及T细胞亚群的变化情况，分析二者的相关性。结果感染组ATP明显低于稳定组和对照组，排异组ATP明显高于稳定组和对照组(P均＜0.05)。与稳定组比较，排异组受者外周血T淋巴细胞百分比及/均明显升高(P均＜0.05)。与稳定组比较，感染组受者外周血T淋巴细胞百分比及/明显降低(P均＜0.05)。感染组与ATP呈正相关，/与ATP无相关性;排异组/与ATP呈正相关和与ATP无相关性。感染组感染治愈后ATP明显回升，排异组在急性排异反应治愈后ATP明显下降(P＜0.05)。结论肝移植术后联合检测T细胞ATP和T淋巴细胞亚群，对判断肝移植受者的免疫状态、移植后感染和诱导免疫耐受均有重要作用。

关键词:肝移植; ATP; T细胞亚群;感染;排异反应;器官移植;免疫功能

Key words: liver transplantation; ATP; T-lymphocyte subsets; infection; rejection; organ transplantation; immune function

肝脏移植是治疗终末期肝病惟一有效的方法，准确客观地评价肝移植受者术后的免疫状态有助于免疫抑制剂的合理应用。采用ImmuKnow技术检测T细胞内ATP水平，能够快捷、准确地评估免疫抑制人群整体细胞免疫功能状态［1］。T细胞亚群也可用于移植后免疫功能监测，T淋巴细胞绝对计数过低易导致严重的感染，/过高易导致排异反应的发生［2］。本研究通过检测肝移植术后患者外周血中T细胞内ATP水平和T细胞亚群，探讨这两种指标对免疫功能的监测作用。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2011年1月～2014年6月在我院行肝移植术后随访患者80例，男58例、女22例，年龄22～67(48.0±11.3)岁，随访时间0.5～3.0年。原发病为乙肝后肝硬化56例，原发性肝癌5例，重症肝炎17例，丙肝后肝硬化2例。其中术后病情稳定30例(稳定组)、出现感染30例(感染组)、发生急性排异反应20例(排异组)。另选健康体检者30例作为对照组，男21例、女9例，年龄25～41(33.6± 8.9)岁。各组性别、年龄具有可比性。

1.2观察指标检测稳定组术后1年，感染组和排异组术后1、2、6个月，发生感染或急性排异反应时，发生感染或急性排异反应治愈后1个月及对照组入组时的外周血T细胞内ATP水平，以术后1、2、6个月ATP均值作为术后随访均值;检测感染组和排异组发生感染或急性排异反应时、稳定组术后1年外周血T细胞亚群。

1.2.1T淋巴细胞内ATP检测采用Cylex+ ImmuKnow方法。采集受试者空腹外周血，肝素钠抗凝，加入植物血凝素，37℃、5% CO2共孵育15～18 h。向标本中加入耦联磁珠的抗CD4单克隆抗体，分离出T细胞。加入细胞裂解液，裂解T细胞并使其释放细胞内ATP。加入发光试剂，用荧光光度计测量吸光度值，测3次计算均值，用标准曲线换算ATP的质量浓度。

1.2.2T细胞亚群检测采用流式细胞术。采集受试者空腹外周血，EDTA抗凝。根据需要检测的T细胞的不同亚群，向试管中加入相应的荧光标记单抗，混匀，室温避光孵育15 min。加入红细胞裂解液1 mL，避光放置10 min，待红细胞裂解完全后，离心弃上清液，加入PBS 0.4 mL，上流式细胞仪检测，使用配套软件计算、所占百分比及/。

1.3统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量资料多组间均数比较采用方差分析，相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CD4T淋巴细胞内ATP水平稳定组术后1年、感染组发生感染时、排异组发生急性排异反应时、对照组入组时的ATP水平分别为(436.3± 165.4)、(195.3±107.4)、(540.6±197.6)、(400.0 ±78.2) ng/mL。感染组明显低于稳定组和对照组，排异组明显高于稳定组和对照组(P均＜0.05)。感染组中，24例(80%)发生感染时ATP低于术后随访的平均值(感染后1个月)，感染治愈后ATP明显回升;其余6例变化不明显。排异组中，9例(45%)发生排异时ATP高于术后随访的平均值，排异治愈后ATP明显下降;其余11例变化不明显。见表1。

表1　感染组及排异组发生感染或急性排异及治愈后ATP水平比较(±s)

注:与感染(排异)发生时比较，*P＜0.05。

组别　n ATP(ng/mL)感染(排异)发生时术后随访均值感染(排异)治愈后感染组　24 195.3±107.4 239.2±117.5*205.4±122.2排异组　9 540.6±197.6 476.3±102.4*496.2±155.4

2.2T细胞亚群见表2。与稳定组比较，排异组发生急性排斥反应时外周血、T淋巴细胞百分比及CD4/CD8均明显升高(P均＜0.05) ;感染组发生感染时外周血、T淋巴细胞百分比及CD4/CD8均明显降低(P均＜0.05)。

表2　感染组、排异组、稳定组T细胞亚群比较(±s)

注:与稳定组比较，*P＜0.05。

组别n　T 细胞亚群CD+3(%)　CD+4(%)　CD+4/CD+8感染组　24　50.23±18.51*24.68±13.57*1.32±1.58*排异组　9　86.32±16.78*57.82±17.33*3.65±1.47*稳定组30　72.46±19.56 39.64±11.59　1.87±1.55

2.3ATP与T细胞亚群的相关性相关性分析显示，感染组、均与ATP呈正相关(r分别为0.815、0.628，P＜0.05)，/与ATP无明显相关性(r=0.081，P＞0.05) ;排异组/与ATP呈正相关(r=0.789，P＜0.05)和与ATP无相关性(r分别为0.054、0.047，P均＞0.05)。稳定组与ATP无相关性(r分别为0.078、0.061、0.122，P均＞0.05)。

3　讨论

对肝移植术后患者，目前常使用药物浓度监测作为调整免疫抑制剂剂量的标准，但药物浓度与患者免疫功能之间缺乏良好的相关性［4］，无法准确监测免疫功能，导致很多肝移植受者处于免疫抑制过度状态，增加了感染、肿瘤和药物不良反应的发生率［3］。ImmuKnow免疫细胞功能检测能够快捷、准确地评估细胞免疫功能状态，帮助医生掌握有效血药浓度范围［5］。T细胞亚群是评估机体免疫状态的常用方法，和亚群在急性排异时可发生变化。因此联合检测ATP和T细胞亚群对监测肝移植术后患者的感染与排异有一定的诊断意义。

本研究显示，80例肝移植受者中，感染组ATP明显低于稳定组和对照组，排异组ATP明显高于稳定组和对照组，提示肝移植受者ATP与临床感染、移植肝排异反应存在明显相关性。T淋巴细胞内ATP水平降低是肝移植术后感染的危险因素，通过检测ATP水平监测机体的细胞免疫状态，能弥补药物浓度监测的不足，指导临床调整免疫抑制剂的剂量，减少感染发生的风险。研究表明，当移植受者被巨细胞病毒、EB病毒以及肝炎病毒等感染时，细胞介导的免疫力下降，其外周血免疫细胞的ATP水平也随之下降［7］。多中心临床试验结果显示，肝、肺、小肠、胰腺等移植术后，测定T淋巴细胞内ATP水平，可对器官移值免疫功能进行监测，客观评价临床感染、移植物排异反应等风险［8～10］。

本研究对肝移植患者进行术后随访，结果显示感染发生时移植受者ATP低于术后平均水平，感染治愈后ATP明显回升，表明感染期患者的细胞免疫状态处于较低的水平;排异反应发生时，肝移植受者的ATP高于术后平均水平，排异治愈后ATP明显下降，表明排异期患者的细胞免疫状态处于较高的水平。因此认为，ATP可以很好地反映移植受者当时的免疫状态。

本研究对感染组、排异组ATP与T细胞亚群的关系进行相关性分析，结果显示，感染组均与ATP呈正相关，与ATP无相关性;排异组?与ATP呈正相关，和与ATP无明显相关性。Ahmed等［11］报道，肝移植患者出现术后感染时的?T细胞绝对计数、/均显著低于术前和感染治愈后，当T细胞绝对计数、明显上升时预示感染情况好转。熊海云等［12］认为，动态监测外周血T淋巴细胞亚群的变化对判断感染、急性排异反应和受者的免疫状态有一定的意义。但目前肝移植术后的免疫状态没有统一的标准，且T淋巴细胞亚群、个体差异明显，只有与术前、术后的稳定期和病理期纵向动态进行比较才更有意义。

综上所述，通过检测T淋巴细胞内ATP与T细胞亚群监测肝移植患者的免疫状态，既能减少免疫抑制的用量，还能够减少感染发生的风险，使受者以最少的免疫抑制剂量获得更长的移植物存活时间。

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·基础研究·

Monitoring effects of combined detections of ATP and T lymphocyte subsets inT lymphocytes

of peripheral blood on immune function after liver transplantation LIU Wei，LI Dai-hong，WANG Kai，LIU Chun
(First Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300192，China)

Abstract:Objective To investigate the monitoring effects of combined detections of ATP and T lymphocyte subsets inT lymphocytes of peripheral blood on immune function in patients after liver transplantation.Methods Eighty cases of liver transplant recipients，including 30 cases of patients with stable condition after operation (stable group)，30 cases of patients with infection (infection group) and 20 patients with acute rejection (rejection group)，and 30 healthy controls (control group) were selected.The concentrations of ATP inT lymphocytes were detected by Cylex+ ImmuKnow method，and the percentages of T-lymphocyte subsets were determined by flow cytometry.The changes of ATP and T lymphocyte subsets were compared in each group and their correlations were analyzed.Results The ATP level of the infection group was significantly lower than that of the stable and control groups，and the ATP level of the rejection group was significantly higher than that of the stable and control groups (all P＜0.05).Compared with the stable group，the and ?T lymphocyte percentage，/in the peripheral blood of the rejection group were significantly higher (all P＜0.05) ; and theandT lymphocyte percentage，/in the peripheral blood of the infection group were significantly lower (all P＜0.05).In the infection group，andwas positively correlated with ATP，but/had no correlation with ATP.In the rejection group，/was positively correlated with ATP，but? and were not correlated with ATP.The ATP significantly increased after the cure of infection in the infection group，and the ATP significantly decreased after the cure of rejection in the injection group (P＜0.05).ConclusionThe combined detections of ATP and T lymphocyte subsets inT lymphocytes of peripheral blood in patients after liver transplantation have important significance to the judgment of the recipients immune status，infection and induced immune tolerance.

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者简介:李代红(1966-)，女，主任技师，主要研究方向为临床输血和移植免疫。E-mail: ldh_hla@163.com

作者简介:第一刘伟(1980-)，女，主管技师，主要研究方向为移植免疫。E-mail: liuwei2024@126.com

基金项目:天津市卫生局科技基金(2013KZ035)。

文章编号:1002-266X(2015)18-0024-03

文献标志码:A

中图分类号:R617

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.008