罗纪军

摘要 研究利用液相色谱-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）快速准确测定乳制品中双酚A和壬基酚。通过一系列试验对样品前处理进行了优化研究，样品经乙酸乙酯∶环己烷（1∶1，体积比）提取净化后，采用HPLC-ESI-MS/MS检测分析，在多反应监测模式（MRM）下，采用内标法定量。方法的检出限为1 μg/kg，在1～200 μg/kg范围内线性关系良好（相关系数 r>0.99），平均添加回收率为75%～85%，该方法简便、高效、准确，各项技术指标均满足国内外有关双酚A和壬基酚检测要求，可用于乳制品中双酚A和壬基酚的分析测定。

关键词 双酚A；壬基酚；乳制品；高效液相色谱-串联质谱

中图分类号 TS207.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）01-0288-02

Abstract A new method using of ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry for the analysis of BPA and NP was developed.Sample preparation and HPLC-MS/MS analytical conditions were examined and optimized critically by use of a series of experiments in this study.Samples were extracted by ethyl acetate and cyclohexane，then cleaned up，and ultimately adopted LC-ESI-MS/MS method for qualitative and quantitative analysis.Limits of detection（LOD）was 1μg/kg，and the method showed good linearity（r>0.99）between 1 μg/kg and 200 μg/kg.The average recoveries were between 75% to 85%.The method is simple，efficient，sensitive and accurate，and it can meet the requirements of determination for BPA and NP.

Key words BPA；NP；dairy products；liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

近几年，随着我国乳业工业的快速发展，产量大大提高，2009年全国规模以上乳制品企业工业总产值已达1 650亿元，乳制品总产量达1 935万t，人均消费量也大幅度增加。同时，人们对乳制品安全问题也提出了更高要求，特别是2008年“三聚氰胺”奶粉事件后，消费者对于乳制品安全性问题可谓是谈虎色变，发展“安全乳业”已提上了日程。2008年10月6日国务院第28次常务会议通过的《乳品质量安全监督管理条例》已经公布施行，2009年修订的“乳制品工业产业政策”等更进一步证明了我国政府加强乳制品质量安全保障的坚强信心和决心。近年来，环境激素对人类的威胁已经引起广泛的关注，通过污染食品进入人体是其影响人类健康的重要途径。

双酚A和壬基酚是重要的化工原料，被广泛用于工业制备合成洗涤剂、增湿剂、润滑油添加剂、增塑剂等，是环境中广泛分布的污染物，目前调查发现双酚A和壬基酚普遍存在于各类食品中。双酚A和壬基酚是一种内分泌干扰物，具有雌激素样效应，能够对机体产生毒害作用。大量体内外试验证明了双酚A和壬基酚的雌激素样效应和生物毒性，其对生物体产生的不良作用包括对内分泌系统、生殖系统和免疫系统的影响以及致癌作用等[1-2]。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪器。氮吹仪（美国，Organomation Associates，Jnc）；离心机（德国，HERMLE Z-323 K）；液相色谱串联质谱仪（美国安捷伦公司生产，6490 Triple Quad LC/M）；混匀器（德国，IKA MS 3basic）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司生产，KQ5200 DE）；Milli-Q去离子水发生器（美国，Millipore）。

1.1.2 试剂。氨水（优级纯）；试验用水为Milli-Q去离子高纯水；甲醇、乙腈（色谱纯，TEDIA，USA）；25 mL比色管；双酚A和壬基酚及其同位素内标（BPA-D4、NP-D4）均购于Dr公司。

1.2 样品提取与净化处理

直接称取乳制品样品2.0 g于25 mL比色管中，加入10 mL乙酸乙酯∶环己烷（1∶1，体积比），涡旋均匀，超声提取15 min，于4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液用于氮吹管中，45℃水浴氮吹干，2 mL 0.1%氨水+甲醇（体积比，1∶1）定容，-18 ℃下冷冻12 h后，3 000 r/min离心5 min直接将上清液倒入进样瓶中供液质分析，同时进行试剂空白试验[3-4]。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 液相色谱条件。捕集柱：Waters Isolator Column（P/N 186004476），捕集柱位于进样阀之前（图1），根据仪器性能调至最佳状态。色谱柱，Agilent extend C18柱，1.8 μm，50.0 mm×2.1 mm（内径）或相当者；柱温35 ℃；流速0.30 mL/min；进样量10 μL；流动相，A为0.1%氨水溶液，B为甲醇；梯度洗脱条件见表1[5-6]。

1.3.2 质谱分析条件。质谱条件：离子源，电喷雾电离ESI（-）；干燥气温度350 ℃；干燥气流速14 L/min；雾化气压137.9 kPa；毛细管电压4 000 V；采用多反应监测（Multi-selected reaction monitoring，MRM）模式采集数据。具体的离子采集参数见表2[7-8]。

2 结果与分析

2.1 样品提取条件优化

2.1.1 提取溶剂的选择。乳制品主要有婴儿乳粉及液体乳等，这类样品称样后特别是乳粉加入乙腈很容易发生结块，在超声条件下都不能分散开，影响提取效果，但是选择乙酸乙酯∶环己烷（1∶1，体积比）作为提取剂时则不会发生结块现象，因此乳制品的提取溶剂选择为乙酸乙酯∶环己烷（1∶1，体积比）。

2.1.2 净化方式的选择。在查阅相关资料的基础上得知，双酚A和壬基酚作为化工原料广泛应用于包装材料中，因此在前处理过程中不能接触塑料制品，通过试验用一次性注射器吸取适量定溶液通过0.22 μm有机系滤膜和不过膜直接进样对比发现，定溶液接触注射器和滤膜等塑料制品后明显有壬基酚溶出，因此在前处理过程中不能接触塑料制品。其他文献资料也显示，各种固相萃取小柱都会发生壬基酚溶出现象，因此也不能选择固相萃取作为净化方式。

乳制品经过提取剂提取后油脂含量很大，因此净化的目标就是要消除脂肪对检测结果的影响，在参考其他资料的基础上发现冷冻也是一种很好除油脂的方法，特别是在 -18 ℃下冷冻12 h后会明显发现有脂肪颗粒析出，此时再立即进行离心、转移能够有效除去部分油脂，减少基质对目标的影响。

2.1.3 流动相的选择。对甲醇-水和乙睛-水2种流动相进行对比分析，发现以甲醇-水为流动相的双酚A、壬基酚和其内标物质的响应值为以乙睛-水为流动相的2～4倍，显著偏高。因此，试验中液相色谱-质谱分析方法中选用甲醇-水作为流动相。

目标化合物的离子化效率受到流动相组成的影响，此外，还会受到流动相中加入的添加剂影响。试验中，将一定量的甲酸、乙酸铵和氨水分别加入到甲醇-水流动相中，研究其对目标化合物离子化效率的影响。结果表明，当在流动相中加入一定量的氨水时，目标化合物的响应值发生明显的增加，为仅使用甲醇-水为流动相时的2～3倍；当加入一定量的甲酸或乙酸铵后，由于加入的乙酸铵抑制了目标化合物的离子化效率，目标化合物的响应均有所降低（图2）。分析表明，由于壬基酚、辛基酚和双酚A等带有羟基，能够电离出1个氢离子，使溶液呈弱酸性，所以在流动相中加入一定的碱性物质（如氨水）时，由它提供的氢氧根离子会与氢离子结合产生水分子，从而消耗氢离子，以达到促进目标化合物进一步电离，起到提高目标化合物的离子化效率的作用。

2.2 仪器条件的选择

在LC-MS/MS分析中，色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的。为了使每个组分都得到分离和鉴定，以获得最大的灵敏度，必须设置合适的色质分析条件，特别是质谱条件。

色谱条件包括色谱柱类型、流动相组成、流动相大小、柱温等。质谱条件包括离子源、离子化模式、离子源温度、雾化气流量、质量扫描范围、定量检测模式等，这些都要根据样品情况进行设定。本研究优化的仪器分析条件分别见表1、表2。标准样品多反应监测（MRM）色谱分析见图3。

2.3 线性关系、回收率、精密度与检出限

在优化的测定条件下，配制一系列不同浓度的混合标准溶液进行测定，以各组分定量离子的峰面积对浓度绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表3。结果表明，在1～200 μg/kg范围内，双酚A和壬基酚的质量浓度和定量离子的峰面积呈良好的线性关系。采用在空白样品中添加标准溶液的方法，分别进行不同乳制品样品中双酚A和壬基酚5个水平的添加回收率试验，每个水平进行 6次重复，得到结果的平均相对标准偏差为2.05%～4.37%，检出限均为1 μg/kg。

3 结论

通过试验研究，建立了液相色谱串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）法快速、准确测定了乳制品中双酚A和壬基酚。该方法具有快速、灵敏、准确和操作简单的特点，能够较好地应用于各种乳制品中双酚A和壬基酚的分析检测。

4 参考文献

[1] 郭新东，冼燕萍，陈立伟，等.液相色谱串联质谱法测定化妆品中的双酚 A、辛基酚及壬基酚[J].分析测试学报，2012，31（7）：848-852.

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