曹义娟，徐惠，权斌，胡方方，李云鹏，杨亚茹，王洁，庞惠

[东南大学医学院附属徐州医院(徐州市中心医院)1.生殖医学中心，2.胃肠外科，3.中心实验室，江苏 徐州 221009]

·论 著·

全反式维甲酸改变人乳腺癌细胞外基质微环境的研究

曹义娟1，徐惠1，权斌2，胡方方1，李云鹏1，杨亚茹1，王洁3，庞惠3

[东南大学医学院附属徐州医院(徐州市中心医院)1.生殖医学中心，2.胃肠外科，3.中心实验室，江苏 徐州 221009]

目的：研究全反式维甲酸(ATRA)对乳腺癌细胞MCF-7增殖、分化诱导、细胞微环境改变及对乳脂球表皮生长因子8(MFGE8)转录表达的影响，为乳腺癌防治提供理论依据。方法：油红O染色检测ATRA对MCF-7细胞的分化诱导作用及对细胞微环境的影响；台盼蓝染色检测ATRA对MCF-7细胞的增殖抑制率；实时定量PCR检测ATRA对β-casein和对MFGE8转录表达的影响。结果：ATRA对MCF-7细胞有很强的分化诱导作用且呈剂量依赖性，高浓度ATRA诱导MCF-7细胞所形成的脂肪滴大于低浓度时的脂肪滴，脂肪滴主要集中于细胞膜外周及胞浆，改变了细胞微环境及形态结构；ATRA对细胞的增殖抑制率呈剂量依赖性。 2 μmol·L-1ATRA处理细胞1～5d，第4天β-casein转录表达增强最为显著，为7.26倍；第3天MFGE8转录表达增强最为显著，为6.74倍。结论：ATRA诱导MCF-7细胞分化，抑制细胞生长，改变其微环境，进而促使癌细胞逆转。

乳腺癌； 全反式维甲酸； 分化； 微环境改变； 乳脂球表皮生长因子8

全反式维甲酸(ATRA)是维生素A最重要的活性代谢产物。ATRA及其天然、合成的衍生物被统称为视色素。视色素具有分化、抗增殖、凋亡和抗氧化特性，它们是治疗和化学预防多种肿瘤(包括乳腺癌)的有前景的药物。ATRA是第一个临床上应用于治疗急性早幼粒细胞性白血病的细胞分化药物[1]。近年来ATRA对乳腺癌的抑制作用引起了科学家的极大关注[2]。

1997年生物学家John Dick首次报道了肿瘤干细胞(CSCs)[3]。CSCs存在于肿瘤中，可以产生新的肿瘤细胞，它与肿瘤的启动、治疗抵抗、肿瘤复发、血管生成和转移有着密切的关系。近年来，科学家采用药物分化诱导转化CSCs为非肿瘤干细胞，清除CSCs，阻止肿瘤进一步恶化，发挥抗癌效应[4-5]。ATRA能够分化诱导早期转化人上皮细胞形成小管，发生形态学变化，但对高级转化阶段细胞没有显示任何形态学的影响；分化诱导可促使早期转化乳腺癌细胞向正常细胞转变，阻止其进一步恶化[6]。分化诱导所形成的脂肪滴主要集中于胞外间质及胞浆。动态重塑细胞外基质对转移损伤起着重要的作用，而细胞外基质成分的变化参与药物对肿瘤细胞转移的抑制作用[7]。肿瘤细胞外环境参与肿瘤干细胞的增殖、抗氧化效应和干扰素信号传导[8]。环境因素的改变是促使上皮肿瘤干细胞重新编程的有效途径[9]，肿瘤微环境是肿瘤靶向药物的重要作用靶[10]。细胞形态的改变参与细胞支架蛋白重新分布，影响细胞的粘连能力，对细胞的侵袭和转移起着重要的作用[11]。因此，分化诱导治疗早期肿瘤可能具有广阔的前景和潜力。目前尚未见关于ATRA改变乳腺癌微环境的报道。本实验将观察不同浓度ATRA对乳腺癌细胞MCF-7分化诱导、细胞形态的变化、微环境的改变、抑制作用及对基因转录表达的影响，进而重新编程癌细胞。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌雌激素受体阳性(ER+)MCF-7细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院。

1.2 仪器

CO2培养箱(REVCO ELITE II)，Bio-Rad iQ5 real time PCR machine。

1.3 试剂

DMEM培养基、小牛血清、谷氨酰胺、青霉素/链霉素、胰岛素、0.25%胰酶-EDTA、ORO、Gills hematoxylin2、ATRA均购自Sigma公司。β-casein、MFGE8引物和RNAqueous-4PCR RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。ATRA溶于DMSO，制备10 mmol·L-1储存液，储存于-80 ℃。

1.4 方法

1.4.1细胞培养 MCF-7细胞用上述10% FBS-0.01 mg·ml-1胰岛素DMEM培养基置于37 ℃恒温、体积分数5% CO2培养箱中培养，待细胞铺满80%时用0.25%胰酶消化传代。

1.4.2油红O染色 1.24×105MCF-7对数生长期细胞接种于6孔培养板内，24 h 后换含有ATRA的新鲜培养基，ATRA的浓度分别为0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1。对照孔加入等体积的DMSO；3 d后换含相同浓度ATRA的新鲜培养基；5 d后4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗2次，用过滤过的ORO液体室温染细胞15 min，50%酒精冲洗3次。用Gills hematoxylin2染1 min，将Gills hematoxylin2倒回瓶子，反复使用。用蒸馏水冲洗，显微镜下观察。脂肪呈红色，胞浆呈粉色，细胞核呈蓝色。ATRA诱导的分化百分比：分化阳性细胞数/总细胞数×100%。实验重复3次。

1.4.3ATRA对MCF-7的生长抑制作用 MCF-7细胞接种于15 cm细胞培养皿，24 h后换含ATRA的新鲜培养基，ATRA的浓度分别为0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1。对照孔加入等体积的DMSO。3 d后换含相同浓度ATRA的新鲜培养基。ATRA处理细胞5 d后，用0.25%胰酶-EDTA消化细胞，用台盼蓝染色计数。ATRA对MCF-7细胞生长的抑制率=(加等体积DMSO对照孔细胞数-加ATRA孔细胞数)/加等体积DMSO对照孔细胞数 ×100%。实验重复3次。

1.4.4定量PCR 按RNAqueous-4PCR(Invitrogen 公司)试剂盒说明书进行，具体步骤如下：细胞接种于10 cm培养皿，24 h后加入ATRA至最终浓度2 μmol·L-1，药物处理细胞共5d，中间第3天换含2 μmol·L-1ATRA的新鲜培养基，吸去培养基，加入500 μl裂解液，用刮刀收集细胞于EP管中。充分振荡，13 000 r·min-1离心3 min。将上清转移至新EP 管，加500 μl 64%酒精振荡混匀，将混合液移至过滤柱内，13 000 r·min-1离心1min，700 μl洗液#1洗柱子，用500 μl 洗液#2/3洗柱子2次，13 000 r·min-1离心30 s。将柱子置于新EP管上，用50 μl 80℃洗脱液洗脱柱子2次，离心30 s。加入0.1倍体积的10×DNaseI缓冲液、1 μl DNaseI，37 ℃ 30 min。加入0.1倍体积DNase失活试剂，放置2 min。加入0.1倍体积5 mol· L-1醋酸胺、0.02倍体积丙烯酰胺、2.5倍体积100%酒精，置于-20℃过夜。13 000 r·min-1离心30min，弃上清，用70%酒精洗RNA 2次，40 μl洗脱液溶解RNA。取适量RNA 稀释至100 μl，在紫外分光光度计上测定OD260 nm和OD280 nm。样品总RNA(μg·μl-1)=OD260 nm×稀释倍数/25。OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0为样品较纯。反转录反应：总RNA 2 μg，Random hexamers 1 μl，10 mmol·L-1dNTP 1 μl，加nuclease-Free蒸馏水至12 μl，70 ℃ 10 min，冰浴。5×First-Strand Buffer 4 μl，0.1 mol·L-1DTT 2 μl，RNaseOUT 1 μl，混匀，室温 10 min，SuperscriptII 1 μl，42 ℃ 45 min，50 ℃ 15 min，70 ℃ 15 min，冰浴。-80 ℃保存备用。通过Primer3软件设计引物。GAPDH作为看家基因。用SYBR Green试剂合扩增45个循环。根据CT值，算出相对表达值。实验重复3次。

2 结 果

2.1 ATRA对MCF-7细胞的分化诱导作用

ATRA对MCF-7细胞的分化诱导作用如图1、2所示。不同浓度ATRA处理MCF-7细胞5d，油红O染色测定MCF-7分化阳性细胞。结果显示，高浓度ATRA(5、2 μmol·L-1)引起细胞外基质形成大的脂肪块，在胞浆内形成小的脂肪滴；当ATRA 1 μmol·L-1以下时，在胞浆及细胞外基质形成小的脂肪滴(Lipid droplet)。0、0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1ATRA引起MCF-7细胞分化百分比分别为2.1%、8.5%、26.3%、31.6%、40.8%、65.3%。其分化诱导阳性百分比对ATRA呈剂量依赖性关系。

2.2 ATRA对MCF-7细胞的生长抑制作用

ATRA对MCF-7细胞的生长抑制作用如图3所示。ATRA在0、0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1时，细胞总数分别为1.24×107、1.22×107、1.20×107、1.09×107、0.99×107、0.71×107。 ATRA对MCF-7细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性关系，抑制率分别为(1.58±1.1)%、(3.21±0.77)%、(12.9±0.47)%、(20.18±2.6)%及(42.76±1.6)%。

2.3 2 μmol·L-1 ATRA对β-casein和MFGE8转录表达的影响

2 μmol·L-1ATRA对β-casein和MFGE8转录表达的影响如图4所示。β-casein是MCF-7细胞分化标志物。定量RT-PCR结果显示，2 μmol·L-1ATRA处理细胞1～5d，β-casein转录活性相对于DMSO对照组分别增强了(0.92±0.16)、(2.49±0.10)、(2.41±0.15)、(7.26±0.58)、(5.82±0.36)倍。此结果表明ATRA对MCF-7细胞具有显著分化诱导作用，在第4天其分化诱导作用最为显著，第5天次之。2d 后ATRA显著增强 MFGE8的转录表达。第1～5天MFGE8转录活性与DMSO对照组相比分别增强了0.29(0.29±0.26)、1.25(1.25±0.30)、6.74(6.74±1.55)、4.64(4.64±0.88)及2.40(2.40±0.59)倍，其中第3天增强最为显著。

3 讨 论

乳腺癌是威胁妇女身体健康的主要疾病，其中约有70%乳腺癌是ER+乳腺癌。药物诱导分化治疗被认为可能是根除肿瘤干细胞的有前景的治疗方法之一。本实验用ATRA处理ER+乳腺癌细胞株MCF-7 5d，当ATRA高浓度(5、2 μmol·L-1)时，在细胞膜外周及胞浆内所形成的脂肪滴聚集成大的脂肪块；当ATRA 1 μmol·L-1以下时，在细胞膜外周及胞浆内形成小的脂肪滴(lipid droplet)。ATRA对MCF-7细胞的分化诱导作用呈剂量依赖性。如图1所示，ATRA改变了MCF-7细胞形态学结构及微环境。微环境的改变可以重新编码乳腺癌程序[12]。十多年前科学家提出了组织结构领域理论(tissue organization field theory，TOFT)。此理论认为，肿瘤是一个可以逆转的过程，肿瘤细胞与周围环境之间相互作用的改变可以逆转肿瘤表现型。这种相互作用对肿瘤的起始、发展、基因表达、分化、凋亡过程起着重要作用。如图3所示，ATRA对MCF-7生长的抑制作用呈剂量依赖性，这与文献[6]报道的1、10 μmol·L-1ATRA抑制细胞生长和改变细胞形态结构的结果相吻合。

图1 不同浓度ATRA对MCF-7细胞的分化诱导作用(×40)

图2 不同浓度ATRA引起MCF-7细胞分化诱导百分比

牛奶蛋白基因的表达水平反映了上皮细胞的分化能力[13]，β-casein是主要牛奶蛋白，是乳腺上皮细胞分

图3 ATRA对MCF-7细胞的抑制作用

化标志物[14]。图4表明2 μmol·L-1ATRA处理MCF-7细胞1～5d，β-casein的转录表达在5d内均显著增强，第4天分化诱导作用最为显著，其mRNA表达提高了7.26倍，第5天次之，提高了5.82倍，此结果与油红O染色脂肪滴测定结果相吻合，均表明ATRA是ER+乳腺癌MCF-7细胞强分化诱导药物，可能具有广阔的乳腺癌治疗潜力。MFGE8对维持上皮内环境稳定，促进黏膜愈合起着重要作用，其表达随ER+乳腺癌病情发展而下调，其转录表达微弱减少能够增强ER+乳腺癌增殖，此基因是乳腺癌标志物和治疗靶[15]。本实验(图4)显示2 μmol·L-1ATRA处理MCF-7细胞1～5d，2d 后MFGE8表达显著上调，3d 后MFGE8转录表达最为显著，与DMSO对照组相比增强6.74倍，此结果表明ATRA能够促进MFGE8表达恢复和逆转，这对抑制MCF-7癌细胞的生长起着重要的作用。 ATRA改变MCF-7胞外基质微环境和显著增强β-casein、MFGE8的转录表达，在PubMed中均未见报道。本研究揭示ATRA诱导MCF-7细胞分化，抑制其生长，改变胞外基质微环境，进而促使乳腺癌细胞重新编程和逆转，为乳腺癌防治提供理论依据。

图4 2 μmol·L-1ATRA对β-casein及MFGE8转率表达的影响

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The study of microenvironment modification of extracellular matrix in breast cancer by all-trans retinoic acid

CAO Yi-juan1，XU Hui1，QUAN Bin2，HU Fang-fang1，LI Yun-peng1，YANG Ya-ru1，WANG Jie3，PANG Hui3

(1.ReproductiveCentre; 2.GastrointestinalSurgeryDivision; 3.LaboratoryCentre，XuzhouCentralHospital，theAffiliatedXuzhouHospitalofMedicalSchoolofSoutheastUniversity，Xuzhou221009，China)

Objective: This study was designed to investigate the effects of ATRA on the proliferation，differentiation，microenvironment and MFGE8 transcription of breast cancer cells (MCF-7)，which will provide theoretical basis for breast cancer therapy. Methods: Oil red O staining was used to estimate the differentiation induction and microenvironment modification of MCF-7 by ATRA. The inhibitory effect of ATRA on MCF-7 was determined by trpan blue exclusion. The effect of ATRA on ß-casein and MFGE8 transcription was demonstrated by real time PCR. Results: MCF-7 differentiation was obviously induced by ATRA in a dose-dependent manner. Lipid droplets induced by high concentrations of ATRA were much larger in size than that induced by low concentrations. Lipid droplets located in cytoplasm and outside of cell membranes modified the microenvironment and the cell structure. The inhibition rates of cell proliferation by different concentrations of ATRA were in a dose-dependent manner. After MCF-7 treatment with 2μmol·L-1ATRA for 1 to 5 days，β-casein transcription increased most by 7.26-fold on the fifth day. In the meantime，MFGE8 transcription increased most by 6.74-fold on the third day. Conclusion: ATRA exerts the effects on the proliferation，differentiation and microenvironment of MCF-7 cells，which can be further reprogrammed and reversed.

breast cancer； all-trans retinoic acid； differentiation，microenvironment； milk fat globule EGF factor Ⅷ

2015-06-19

2015-08-25

曹义娟(1974-)，女，江苏徐州人，副主任医师，医学硕士。E-mail:xzjj2002@126.com

权斌 E-mail:1472164106@qq.com

曹义娟，徐惠，权斌，等.全反式维甲酸改变人乳腺癌细胞外基质微环境的研究[J].东南大学学报：医学版，2015，34(6)：992-996.

R737.9

A

1671-6264(2015)06-0992-05

10.3969/j.issn.1671-6264. 2015. 06．030