弓玉祥，丁丽红，杨旻宇，刘必成，倪海锋

(东南大学附属中大医院 肾脏病研究所，江苏 南京 210009)

·论 著·

IgA肾病肾小管间质中淋巴细胞亚群分布及其临床意义探讨

弓玉祥，丁丽红，杨旻宇，刘必成，倪海锋

(东南大学附属中大医院 肾脏病研究所，江苏 南京 210009)

目的：探讨IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)肾小管间质中淋巴细胞亚群分布与临床肾功能的关系及其意义。方法：对48例IgAN患者穿刺肾组织石蜡切片行Masson三色染色，按牛津分类将48例IgAN患者分为T0、T1和T2组，用CD4、CD8和CD20一抗行免疫组化染色，分别标记T淋巴细胞亚型(CD4、CD8)和B淋巴细胞(CD20)。采用Image-Pro Plus图像分析系统分析免疫组化结果，结合相关病理参数(肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化程度)及临床指标，应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。结果：CD4+、CD8+、CD20+的细胞数量在不同纤维化组别间差异有统计学意义(P<0.05)。CD4+、CD8+、CD20+的细胞数量与不同临床、病理指标呈正相关。结论：间质中浸润淋巴细胞的不同数量和类型影响IgAN临床特征及肾脏纤维化的进展。

IgA肾病； 肾小管间质； 淋巴细胞； 肾功能

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，15%～40%的患者呈进行性发展，在发病10～20年后进展为终末期肾病(end stage of renal disease，ESRD)。IgAN与其他类型的肾脏疾病一样，肾小管间质炎症及纤维化是疾病发展至ESRD的共同途径，是决定肾脏疾病预后的主要因素。然而，肾小管间质炎症和纤维化的机制尚不明确，所以有必要揭示肾组织炎症细胞浸润状况以及与纤维化程度、临床表现之间的关系。为此，我们研究了IgAN不同程度的间质炎症反应，观察了肾小管间质中淋巴细胞在肾脏纤维化不同阶段的亚群分布及数量，并初步探讨了其相关关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择东南大学附属中大医院2010年1月至2012年10月的48例肾活检患者，入选病例的标准[1]为：(1) 确诊为原发性IgAN患者；(2) 年龄、性别不限；(3) 有完整的临床观察指标与病理观察指标；(4)肾活检之前未接受激素和免疫抑制剂治疗；(5) 无其它肾小球疾病或肾小管间质疾病，无其它继发性肾损害，如糖尿病、系统性红斑狼、过敏性紫癜、乙型肝炎、肝硬化、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等全身性疾病；(6)肾穿刺标本所得肾小球数大于5个。其中男22例，女26例；年龄20～44岁，平均32岁。血肌酐浓度(179.56±72.60) μmol·L-1，尿N-乙酰-β-D-葡萄糖(NAG) (24.98±19.71)U·L-1，24 h尿蛋白(2.0±1.75)g·L-1。牛津分类病理特征: 小管萎缩和纤维化T0 32例，T1 9例，T2 7例。

1.2 主要试剂及耗材

CD4、CD8、CD20一抗购自北京中山生物技术公司，免疫组化试剂盒KIT 9921购自福州迈新公司。

1.3 方法

1.3.1常规染色方法 所有肾活检组织均行石蜡包埋，普通染色切片厚度2 μm，行Masson染色。

1.3.2免疫组化方法 免疫组化切片厚度3 μm，免疫组化步骤按说明书进行，以PBS 代替一抗作阴性对照。采用Image-Pro Plus 图像分析系统，对采集的图像进行分析。采用双盲法对间质中浸润的炎症细胞进行计数：每张切片随机选择20 个不含肾小球的高倍视野，计数肾间质中浸润的淋巴细胞数，结果以在高倍显微镜下炎症细胞数×400 表示。

1.4 统计学处理

计量资料以均数±标准差表示，应用SPSS 13.0统计软件行两样本均数t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同纤维化组间临床特征比较

根据牛津分类肾小管纤维化的程度，将IgAN患者分为3组，即T0组(肾小管间质纤维化的程度<25%)、T1组(25%≤肾小管纤维化的程度≤50%)和T2组(肾小管纤维化的程度>50%)。3组患者年龄和性别间差异无统计学意义，随着肾小管间质纤维化进展，血肌酐、尿NAG、24 h蛋白尿量有明显升高(表1)。

表1 不同纤维化组IgAN患者的临床特征

Tab 1 Clinical characteristics in different groups of IgAN patients

与T0组相比，aP<0.05; 与T1组相比，bP<0.05

2.2 肾脏间质病变及淋巴细胞浸润情况

用CD4、CD8和CD20一抗行免疫组化染色结果显示，肾小管间质损伤程度不等：有的纤维化轻微、仅少量淋巴细胞浸润；有的纤维化明显伴多量淋巴细胞散在或密集浸润。CD4、CD8和CD20阳性细胞主要浸润于肾小管间质中(图1)。T1和T2组IgAN患者肾间质中CD4+、CD8+和CD20+细胞数均明显高于T0组(P<0.05)，T2组中CD4+、CD8+和CD20+细胞数量明显高于T1组(P<0.05，表2)。

A.Masson染色显示不同程度的小管间质纤维化； B.CD4+T 细胞； C.CD8+T细胞； D.CD20+B细胞

图1 不同淋巴细胞亚型在IgAN患者肾间质中的浸润情况

Fig 1 Lymphocytes and their subsets infiltration in renal tubulointerstitiumof IgA nephropathy

表2 淋巴细胞亚群在IgAN患者肾脏不同纤维化组的浸润数量情况

Tab 2 The number of lymphocytes and their subsets infiltration in renal tubulointerstitium of IgAN

与T0组相比，aP<0.05; 与T1组相比，bP<0.05

2.3 肾脏间质中不同淋巴细胞的浸润数量与临床病理指标之间的关系

2.3.1肾小管间质中CD4+T细胞的数量与临床病理指标之间的关系 CD4+T细胞的数量与肾活检时血肌酐(r=0.879，P<0.05)、间质纤维化(r=0.895，P<0.05)、24 h尿蛋白(r=0.736，P<0.05)及尿NAG(r=0.359，P<0.05)呈正相关(图2)。

图2 肾小管间质中CD4+T细胞的数量与临床病理指标之间的关系

Fig 2 The relationship between the number of CD4+T cells in renal tubulointerstitium and clinical characteristics

2.3.2肾小管间质中CD8+T细胞的数量与临床病理指标之间的关系 CD8+T细胞的数量与肾活检时血肌酐(r=0.874，P<0.05)、间质纤维化(r=0.884，P<0.05)、24 h尿蛋白(r=0.836，P<0.05)和尿NAG(r=0.530，P<0.05)呈正相关(图3)。

图3 肾小管间质中CD8+T细胞的数量与临床病理指标之间的关系

Fig 3 The relationship between the number of CD8+T cells in renal tubulointerstitium and clinical characteristics

2.3.3肾小管间质中CD20+B细胞的数量与临床病理指标之间的关系 CD20+B细胞的数量与肾活检时血肌酐(r=0.903，P<0.05)、间质纤维化(r=0.867，P<0.05)、24 h尿蛋白(r=0.935，P<0.05)、尿NAG(r=0.868，P<0.05)呈正相关(图4)。

图4 肾小管间质中CD20+B细胞的数量与临床病理指标之间的关系

Fig 4 The relationship between the number of CD8+T cells in renal tubulointerstitium and clinical characteristics

3 讨 论

肾小管间质病变在慢性肾脏病进展中的作用越来越受到人们的重视，大量研究证明小管间质受累程度是肾脏转归的重要影响因素。慢性间质小管病变，如小管萎缩、间质纤维化等特征性病理变化，已被公认为预后不良的指标，对疾病预后有重要意义[2-3]。国际IgAN协作组和肾脏病理学会提出的具有循证医学证据的IgAN牛津病理分类，表明肾小管间质纤维化有独立的预后意义。炎症反应是肾小管间质纤维(TIF)的始动环节之一并贯穿其始终。研究表明，严重的小管间质炎症细胞浸润和患者的预后相关[4-5]。炎症细胞中T细胞是不均一的细胞群体，根据细胞表面CD4与CD8分子表达情况的不同，分为CD4+与CD8+T 细胞。CD4+T细胞识别由抗原递呈细胞递呈的MHC Ⅱ类分子复合物，辅佐B细胞产生免疫球蛋白，促进B细胞亲和力成熟和转化，决定抗原特异性的免疫应答[6]。CD8+T 细胞通常识别MHC Ⅰ类分子，与直接的细胞毒作用有关[7]。免疫反应中，T细胞参与细胞免疫，而B细胞参与体液免疫。B细胞具有抗原递呈作用，协作T细胞发挥细胞免疫。此外，B淋巴细胞具有潜在分泌炎症因子的能力。炎症因子的释放也是导致慢性炎症持续存在的原因之一。T细胞亚群在肾脏纤维化的进展中意义未明，对于B细胞在肾脏中作用的研究相对比较少。

已有部分研究对肾间质中浸润的不同淋巴细胞进行了观察，Alexopoulos等[5，8]报道，CD4+细胞可能通过识别肾小管上皮细胞上的MHC Ⅱ类抗原释放细胞因子IFN-γ、IL-3、TNF-β导致间质纤维化，从而影响IgAN的进展。近年来，Steinmetz等[9-11]发现,在免疫介导的肾脏疾病中，如移植排斥反应和性肾小球肾炎有B细胞存在。肾内B细胞与肾功能恶化相关[9，12]，B细胞可能在不同的肾脏疾病中意义不同[13]。本研究结果显示，IgAN患者的肾组织间质中有不同炎症细胞浸润，如 T细胞及B细胞，且T细胞及亚型(CD4+和CD8+)和B细胞(CD20+)的数量与肾功能恶化密切相关。

综上所述，IgAN患者肾小管间质中可见不同的淋巴细胞亚群浸润，并随着间质纤维化的进展，CD4+、CD8+、 CD20+等淋巴细胞数量增多，CD4+、CD8+、CD20+的淋巴细胞数与间质纤维化、肾功能、24 h尿蛋白和尿NAG含量呈正相关,浸润淋巴细胞的不同数量和类型影响了IgAN临床特征和肾脏纤维化的进展。

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The distribution and clinical significance of lymphocytes and their subsets in renal tubulointerstitium in IgA nephropathy

GONG Yu-xiang，DING Li-hong，YANG Min-yu，LIU Bi-cheng,NI Hai-feng

(InstituteofNephrology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity,Nanjing210009，China)

Objective：To investigate the distribution and clinical significance of lymphocytes and their subsets in renal tubulointerstitium of IgA nephropathy (IgA nephropathy，IgAN).Methods：We stained paraffin sections of 48 cases of IgAN patients for Masson. According to Oxford classification，48 cases of IgAN patients were divided into 3 groups: T0，T1 and T2. CD4，CD8 and CD20 primary antibodies were immunohistochemically stained，and marked as T lymphocyte subsets(CD4+，CD8+)，B lymphocytes(CD20+)，respectively. Immunohistochemistry results were analyzed by Image-Pro Plus image system，combined with the related pathological parameters(glomerulosclerosis，tubular atrophy，interstitial fibrosis) and clinical index. We also used SPSS 13 statistical software for statistical analysis.Results：There was a significant difference between the quantity of CD4+，CD8+，CD20+cells between different fibrosis groups，P<0.05. The number of cells of CD4+，CD8+and CD20+was positively correlated with different clinical and pathological indexes.Conclusion：The number and type of infiltrating lymphocytes in renal tubular interstitium influence IgAN clinical features and the progress of renal fibrosis．

IgA nephropathy; renal interstitial; lymphocyte; renal function

2015-03-27

2015-08-17

国家自然科学基金青年基金项目(81400700)

弓玉祥(1966-)，男，江苏张家港人，主管技师。E-mail:nj_gyx@163.com

倪海锋 E-mail:nihaifeng1979@163.com

弓玉祥，丁丽红，杨旻宇，等.IgA肾病肾小管间质中淋巴细胞亚群分布及其临床意义探讨[J].东南大学学报：医学版，2015，34(6)：876-880.

R692.6

A

1671-6264(2015)06-0876-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．004