顾海伦，刘亚莉，王维，丁立峰，刘莉

(1.中国医科大学附属盛京医院 骨外科，辽宁 沈阳 110004； 2.辽宁医药职业学院卫生检验教研室，辽宁 沈阳 110010； 3.中国医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，辽宁 沈阳 110122)

·论 著·

瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达的影响

顾海伦1，刘亚莉2，王维1，丁立峰1，刘莉3

(1.中国医科大学附属盛京医院 骨外科，辽宁 沈阳 110004； 2.辽宁医药职业学院卫生检验教研室，辽宁 沈阳 110010； 3.中国医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，辽宁 沈阳 110122)

目的：探讨瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶-13 (MMP-13)mRNA表达的影响及其机制。方法：体外培养大鼠膝关节软骨细胞，取第3代细胞采用免疫细胞化学方法及甲苯胺蓝染色法鉴定 Ⅱ 型胶原及蛋白多糖表达；MTT法检测不同质量浓度瘦素环境下正常及IL-1β诱导软骨细胞的增殖活力；实时定量PCR法检测不同质量浓度瘦素处理后IL-1β诱导软骨细胞MMP-13 mRNA的表达，ELISA法检测培养基上清肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平；通过小RNA干扰(siRNA)抑制瘦素长型受体(OB-Rb)表达，观察瘦素对MMP-13 mRNA表达的影响。结果：所有细胞均能分泌 Ⅱ 型胶原及蛋白多糖。MTT结果显示，低质量浓度瘦素对细胞增殖无明显影响，瘦素质量浓度大于等于10 ng·ml-1后可显著促进细胞增殖；而10 ng·ml-1的 IL-1β可显著抑制细胞增殖，同时给予100 ng·ml-1及1 μg·ml-1瘦素则可进一步抑制细胞增殖，差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR结果显示，IL-1β可增加软骨细胞MMP-13 mRNA表达及TNFα分泌，而加入瘦素(100 ng·ml-1)后可进一步刺激MMP-13 mRNA的表达及TNFα的分泌，差异具有统计学意义(P<0.05)。转染OB-Rb siRNA的软骨细胞OB-Rb mRNA的表达显著下降(P<0.05)，MMP-13 mRNA的表达则不受影响；IL-1β处理对转染组OB-Rb的 mRNA表达无明显影响，但可显著诱导MMP-13 mRNA的表达增加(P<0.05)，进一步加入瘦素后，OB-Rb mRNA的表达有所增加，但表达量远远低于siRNA未处理组，差异具有统计学意义(P<0.05)，MMP-13 mRNA的表达则未见增加。结论：一定浓度的瘦素可通过与OB-Rb结合促进IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达，具有降解软骨作用。

瘦素； 骨性关节炎； 软骨细胞； 基质金属蛋白酶-13； 瘦素长型受体； 大鼠

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要特征的慢性关节疾病，表现为关节的进行性疼痛、僵硬、功能障碍，严重影响患者的生活质量。目前研究发现，在OA患者的关节滑液中可检测到瘦素(leptin)，且严重OA患者关节滑液中的瘦素水平更高[1-3]。许多学者[4-5]在对OA损害软骨和正常软骨的检测中发现，其瘦素及其受体的mRNA和蛋白表达水平与软骨损害程度相关，损害越重，表达越高。以上研究均表明，瘦素在OA的病理过程中发挥重要的作用，但关于瘦素对OA的确切作用机制目前还不十分清楚。因此，本研究拟通过体外培养大鼠膝关节软骨细胞，并加入白介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)模拟OA时软骨细胞的环境，检测不同质量浓度瘦素对软骨细胞活性、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)mRNA表达及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα)分泌的影响；并通过小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)抑制瘦素长型受体(long form leptin receptor，OB-Rb)表达来探讨瘦素对IL-1β诱导OA软骨细胞的效应及作用机制，为阐明OA的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 大鼠关节软骨细胞的分离及培养

雄性Wistar大鼠(SPF级)5只，体质量180～200 g，由中国医科大学实验动物部提供。乙醚麻醉后，全部颈椎脱臼处死，体积分数75%乙醇浸泡，无菌环境中取双侧膝关节，削取软骨片，剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm，PBS清洗，800 r·min-1离心5 min后加入0.25%的胰酶，37℃消化1 h，800 r·min-1离心5 min，弃上清，加入含 5% FBS的0.04%Ⅱ型胶原酶，37℃水浴消化过夜；200 目筛网过滤，800 转离心5 min，弃上清，PBS清洗，加入含 10%FBS的 DMEM-F12培养基，制成单细胞悬液，按(1～2)×105ml-1密度接种于25 cm2培养瓶中，37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，72 h更换培养液。所有检测均在细胞第3代进行。

1.2 软骨细胞表型鉴定

细胞爬片达50%～60%，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛，室温固定20 min后分别进行细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的检测。

1.2.1Ⅱ型胶原表达 3% H2O2孵育10 min，山羊血清室温孵育15 min，一抗(1∶100稀释)4℃过夜，生物素标记二抗室温孵育15 min，辣根酶标记链酶卵白素工作液室温孵育15 min。DAB显色，苏木素复染。梯度酒精脱水，中性树胶封片，镜下观察。

1.2.2蛋白多糖 1%甲苯胺蓝染色30 min，梯度酒精脱水，中性树胶封片，镜下观察。

1.3 MTT法检测瘦素对软骨细胞增殖活力的影响

软骨细胞接种于96孔板，每孔100 μl(104个细胞)。细胞分组：调零组、对照组、瘦素处理组(瘦素质量浓度10 pg·ml-1、100 pg·ml-1、1 ng·ml-1、10 ng·ml-1、100 ng·ml-1、1 μg·ml-1)、IL-1β组(10 ng·ml-1)、IL-1β+瘦素处理组(瘦素质量浓度10 pg·ml-1、100 pg·ml-1、1 ng·ml-1、10 ng·ml-1、100 ng·ml-1、1 μg·ml-1)，每组设3个复孔。37℃、体积分数5% CO2条件下孵育24 h，各孔吸弃培养基，加入180 μl含0.5%FBS DMEM-F12培养基，再加入20 μl MTT溶液 (5 mg·ml-1)继续孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，酶联免疫检测仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。

1.4 细胞处理

软骨细胞接种于6孔板中至80%～90%融合后，换用0.5% FBS的培养基，10 ng·ml-1IL-1β预先孵育1 h后进行瘦素处理，分为对照组、IL-1β组和IL-1β+瘦素处理组(瘦素质量浓度100 pg·ml-1、100 ng·ml-1)，每组设3个复孔，24 h后收集细胞及培养基上清，-80℃保存待测。

1.5 OB-Rb siRNA处理软骨细胞

OB-Rb siRNA及对照siRNA均购于美国Santa Cruz公司，转染操作按照说明书进行，1.0 μg OB-Rb siRNA或者对照siRNA转染1×106个细胞。转染后，细胞再继续培养48 h，然后加入10 ng·ml-1IL-1β孵育1 h，之后加入100 ng·ml-1瘦素，24 h后收集细胞。

1.6 MMP-13与OB-Rb mRNA表达检测

采用real-time PCR测定mRNA表达：TRIzol提取总RNA，逆转录后PCR扩增。β-actin作为内参，数据分析采用2-ΔΔCt法。引物序列：β-actin(101 bp) F 5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′，R 5′-CTCAGTGAGGAT

CTTCATGAGGTAGT-3′; MMP-13(146 bp)F 5′-CCCCT

TCCCTATGGTGAT-3′，R 5′-AAGCCAAAGAAAGACTGC-3′；OB-Rb(173 bp)F 5′-GCACCATTTCCGCTTCAATA-3′，R 5′-CTCTTGCTCCTCACCTGGAC-3′。

1.7 培养基上清TNFα水平

采用ELISA法检测，按照说明书操作。

1.8 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，实验所得数据以均数±标准差表示。组间两两比较采用单因素方差分析LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠软骨细胞的分离与培养

大鼠原代软骨细胞培养24 h后开始贴壁，培养1周左右细胞增殖加速，2周左右细胞可长成单层。传代后细胞增殖速度明显加快，细胞形态呈三角形、多角形、梭形。

2.2 软骨细胞鉴定

Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色结果显示，所有细胞胞浆均呈棕黄色，苏木素复染后细胞核呈蓝色，证明所培养细胞均能分泌Ⅱ型胶原,见图1。甲苯胺蓝染色后可见细胞呈蓝紫色，见图2。

图1 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色(×100)Fig 1 Type Ⅱ collagen staining by immunocytochemistry (×100)

图2 蛋白多糖甲苯胺蓝染色(×100)

Fig 2 Proteoglycans staining by Toluidine blue (×100)

2.3 MTT结果

相对低质量浓度瘦素对细胞增殖无明显影响，当瘦素质量浓度大于10 ng·ml-1后可显著促进细胞增殖；10 ng·ml-1的 IL-1β可显著抑制细胞增殖，同时给予瘦素质量浓度在100 ng·ml-1及1 μg·ml-1则可进一步抑制细胞增殖。见图3。

与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01;与IL-1β比较，cP<0.05，dP<0.01。IL-1β质量浓度为10 ng·ml-1

图3 瘦素及IL-1β对大鼠第3代软骨细胞增殖活力的影响

Fig 3 Effect of leptin and IL-1β on the viability of rat chondrocytes in generation 3

2.4 瘦素对IL-1β诱导大鼠OA软骨细胞MMP-13 mRNA表达及分泌TNFα的影响

加入IL-1β后，软骨细胞MMP-13 mRNA表达及TNFα分泌显著增加，而加入瘦素(100 ng·ml-1)后可进一步刺激MMP-13 mRNA的表达及TNFα的分泌。见图4。

2.5 瘦素对OB-Rb siRNA处理的软骨细胞OB-Rb及MMP-13 mRNA表达的影响

转染OB-Rb siRNA的软骨细胞OB-Rb mRNA的表达显著下降，抑制率达50%，与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)；IL-1β处理对其OB-Rb的 mRNA表达无明显影响，而进一步加入瘦素后，OB-Rb mRNA的表达虽有所增加，但表达量远远低于siRNA未处理组(P<0.05)。转染OB-Rb siRNA的软骨细胞MMP-13 mRNA的表达不受影响，而加入IL-1β后可显著增加MMP-13 mRNA的表达，进一步加入瘦素后MMP-13 mRNA的表达则不再增加。见图5。

3 讨 论

OA是中老年人常见的一种慢性疾病，是造成肌肉关节疼痛及失能的最常见原因，但其发病机制还不完全清楚。瘦素是一种主要由白色脂肪组织分泌的细胞因子，在调节能量代谢方面发挥重要作用。近年越来越多的研究显示，瘦素在OA的发生发展中发挥重要作用。研究显示，瘦素及其受体在软骨细胞中表达[4，6]，并且瘦素可影响许多OA相关因子的表达和分泌等[4，7-8]。因此，探讨瘦素在OA的发生发展中的作用机制对于阐明OA发病机制及防治OA具有重要意义。

与对照组比较，aP<0.01;与IL-1β比较，bP<0.05，cP<0.01

图4 瘦素对IL-1β诱导大鼠OA软骨细胞MMP-13 mRNA(A)表达及TNFα(B)分泌的影响

Fig 4 Effect of leptin on the expression of MMP-13 mRNA(A) and TNFα levels (B) in IL-1β-induced rat OA chondrocytes

本研究首先检测了不同质量浓度瘦素对软骨细胞增殖活性的影响。关于瘦素对细胞活力的作用研究有不同的结果。有研究显示，瘦素可促进软骨细胞增殖[9]，但也有报道发现，瘦素对软骨细胞的增殖具有抑制作用[4]。本研究结果显示，对于正常大鼠软骨细

与IL-1β比较，aP<0.01；与对照组比较，bP<0.01;与IL-1β+100ng·ml-1比较，cP<0.01，eP<0.05;与siRNA比较，dP<0.01

图5 瘦素对OB-Rb siRNA处理的软骨细胞OB-Rb(A)及MMP-13 mRNA(B)表达的影响

Fig 5 Effect of leptin on the expression of OB-Rb mRNA(A) and MMP-13 mRNA(B) in OB-Rb siRNA treated rat OA chondrocytes

胞，相对低质量浓度的瘦素无明显促增殖作用，当剂量达10 ng·ml-1时可显著增加细胞活力，说明相对高质量浓度的瘦素可促进正常软骨细胞的增殖。为模拟OA时软骨细胞的体内环境，我们向培养基中加入IL-1β。IL-1β为多肽类物质，在OA的病理过程中发挥主要作用[10]。目前IL-1β作为体外研究中OA的诱导剂已被广泛地使用[11-12]。本研究采用10 ng·ml-1IL-1β，发现该质量浓度的IL-1β可显著抑制细胞增殖。另外，当IL-1β与低质量浓度瘦素共孵育时对细胞的抑制作用与未加瘦素时没有差异，但与高质量浓度瘦素共孵育时，则可进一步地抑制细胞增殖，提示正常与OA时的软骨细胞对瘦素的反应存在差别。诸多研究结果存在差异的原因可能是细胞的来源不同以及对细胞的处理方法不同。根据本研究MTT的结果，我们在之后的实验中选择了对OA软骨细胞增殖无作用的瘦素质量浓度(100pg·ml-1)和有作用的瘦素质量浓度(100ng·ml-1)作为代表来处理细胞，探讨瘦素对IL-1β诱导的大鼠OA软骨细胞的作用机制。

软骨细胞是软骨中唯一的细胞成分，它合成和分泌的Ⅱ型胶原及蛋白多糖构成细胞外基质，在维持软骨功能方面具有重要作用。MMP-13是基质金属蛋白酶家族中的一员，主要降解Ⅱ型胶原[13]，在OA软骨破坏过程中的作用尤为重要。TNFα是一种多功能的炎症细胞因子，对关节软骨具有一定的破坏作用。有研究显示，膝关节术后关节液中的TNFα水平与康复治疗效果呈负相关[14]。瘦素可增加软骨细胞MMP-1，MMP-3、 MMP-9 及 MMP-13的分泌，采用RNA干扰下调瘦素的表达可抑制人OA关节软骨MMP-13的表达[15-17]。但也有报道显示，瘦素可增加软骨细胞增殖及蛋白多糖和胶原的合成[18]，提示瘦素可能也具有合成效应，或者瘦素的分解效应启动了代偿性的合成反应，尤其在OA的早期[19]。本研究中加入IL-1β后软骨细胞MMP-13 mRNA表达及TNFα分泌显著增加，而加入瘦素100 pg·ml-1时，MMP-13 mRNA的表达及TNFα分泌不受影响，但瘦素质量浓度在100 ng·ml-1则可进一步刺激MMP-13 mRNA的表达及TNFα的分泌，表明OA时MMP-13在软骨细胞中高表达，而低浓度瘦素对OA软骨细胞无作用，原因可能是OA时软骨细胞所处的环境中瘦素质量浓度已经很高，再加入低质量浓度的瘦素对其影响甚小。相反，高质量浓度的瘦素可以诱导OA软骨细胞MMP-13的表达，提示100 ng·ml-1的瘦素对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞具有促进基质降解作用。研究发现，瘦素发挥细胞作用主要是通过与长型或短型瘦素受体结合[4，20]，激活STAT、MAPK、NF-κB[15，21]等一系列信号转导通路而进行的。在本研究中我们通过RNA干扰方法抑制OB-Rb mRNA的表达，再检测瘦素对IL-1β诱导MMP-13表达的影响，探讨在OA软骨细胞中瘦素是否可通过与OB-Rb结合发挥对MMP-13的调控作用。结果显示，OB-Rb被抑制后，IL-1β仍可诱导MMP-13 mRNA表达的增加，但再加入瘦素后MMP-13 mRNA 表达并未进一步的增加，说明在软骨细胞中MMP-13的增加至少部分通过瘦素与OB-Rb结合，进而激活瘦素相关信号通路来实现的，但其中涉及的具体信号通路以及是否瘦素还可与其他瘦素受体结合发挥作用还须进一步研究。

综上所述，MMP-13在OA的发生发展中的作用非常重要，而瘦素对软骨细胞的的效应及对MMP-13的影响是多方面的，软骨细胞的来源、种属、瘦素的质量浓度以及OA的严重程度均可产生不同的作用。因此，深入探讨瘦素对MMP-13的影响及机制对阐明OA的发病机制及防治OA具有重要的意义。

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Effect of leptin on the expression of MMP-13 mRNA in IL-1β-induced rat osteoarthritis articular chondrocytes

GU Hai-lun1，LIU Ya-li2，WANG Wei1，DING Li-feng1，LIU Li3

(1.DepartmentofOrthopaedics，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004,China;2.DepartmentofHealthInspection，LiaoningMedicineVocationalCollege，Shenyang110010，China;3.DepartmentofNutritionandFoodHygiene，SchoolofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122，China)

Objective: To determine the effect and mechanism of leptin on the expression of matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) mRNA in IL-1β-induced rat osteoarthritis articular chondrocytes.Methods:Rat articular chondrocytes in generation 3 were identified by immunocytochemistry and toluidine blue staining. Chondrocytes were incubated with leptin in the absence/presence of IL-1β. Cell viability was evaluated using the MTT assay. The expression of MMP-13 mRNA in chondrocytes and TNFα levels in culture supernatants were measured by real-time RT-PCR and ELISA，respectively. In addition，long-form leptin receptor (OB-Rb) siRNA was used to block OB-Rb expression and the effect of leptin on MMP-13 expression was detected.Results:All cultured chondrocytes expressed type 2 collagen and proteoglycan. MTT assay showed that leptin at low concentration had no effect on cell viability，but leptin at high concentration (≥10 ng·ml-1) could significantly promote cell proliferation. Viability of cells exposed to IL-1β (10 ng·ml-1) was significantly impaired，and it was further inhibited in the presence of leptin at 100 ng·ml-1and 1 μg·ml-1(P<0.05). The expression of MMP-13 mRNA and levels of TNF-α were significantly upregulated in the presence of IL-1β，and leptin (100 ng·ml-1) cotreatment could further stimulate MMP-13 mRNA expression and TNF-α level (P<0.05). The expression of OB-Rb mRNA was significantly inhibited，but MMP-13 expression was not affected in those chondrocytes transfected by OB-Rb siRNA. IL-1β treatment could significantly increase MMP-13 expression，but not OB-Rb mRNA in the OB-Rb knock-down cells (P<0.05). The expression of OB-Rb mRNA in IL-1β-treated OB-Rb siRNA cells was dramatically lower than that of untransfected cells (P<0.05) after further addition of leptin，while MMP-13 expression was not affected.Conclusion:Leptin could stimulate MMP-13 expression via OB-Rb in IL-1β-induced rat osteoarthritis articular chondrocytes，which demonstrated that leptin might play an important role in cartilage degradation．

leptin; osteoarthritis; chondrocyte; matrix metalloproteinase 13; long-form leptin receptor; rats

2015-03-20

2015-08-20

国家自然科学基金资助项目(81372971)；辽宁省自然科学基金资助项目(201202267)

顾海伦(1972-)，男，辽宁沈阳人，副教授，医学博士。E-mail:guhailun_@163.com

顾海伦，刘亚莉，王维，等. 瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达的影响[J].东南大学学报：医学版，2015，34(6)：870-875.

R-332; R684.3

A

1671-6264(2015)06-0870-06

10.3969/j.issn.1671-6264. 2015. 06．003