吴丹，王彩莲，李春妍，郑士亚

(1.东南大学医学院附属江阴医院 肿瘤科，江苏 江阴 214400； 2.东南大学附属中大医院 肿瘤科，江苏 南京 210011； 3.南京医科大学，江苏 南京 210029)

·论 著·

胰腺癌Kras基因突变与Glut1高表达协同促进肿瘤发生

吴丹1，王彩莲2，李春妍3，郑士亚2

(1.东南大学医学院附属江阴医院 肿瘤科，江苏 江阴 214400； 2.东南大学附属中大医院 肿瘤科，江苏 南京 210011； 3.南京医科大学，江苏 南京 210029)

目的：探讨胰腺癌组织中Kras基因点突变的表达以及葡萄糖转运蛋白-1(Glut1)表达在促进癌细胞恶性增生中的意义及作用，研究两者之间的相关性。方法：收集46例胰腺癌患者组织蜡块，应用免疫组织化学染色技术检测Glut1在胰腺癌中的表达，荧光定量PCR测序法检测胰腺癌标本中Kras基因点突变率。结果：46例胰腺癌中Glut1的阳性表达为40例(86.9%)，正常癌旁组织中Glut1不表达，两者差异有统计学意义(P<0.01)。Glut1的表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤部位相关(P<0.05)，与性别、淋巴结转移、神经侵犯、病理分级、临床分期、病理类型无关。在46例胰腺癌患者中有26例存在Kras基因点突变(56.5%)，其中24例12密码子突变(G34D 3例，G35D 21例)；2例13密码子突变(G38D 1例，C39D 1例)。Kras基因点突变与肿瘤大小、神经侵犯相关(P<0.05)，与年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤部位、临床分期、病理类型、病理分级无关。胰腺癌中Glut1蛋白呈高表达时，Kras基因存在明显突变，有明显相关性(r=0.99，P<0.05)。结论：Glut1高表达与Kras基因异常表达可能协同促进了胰腺癌的恶性病变。

胰腺癌； Kras基因； 葡萄糖转运蛋白-1； 糖酵解

胰腺癌是恶性程度极高的癌症之一，早期诊断困难，疗效差，总体死亡率高达98%[1]，中位生存期为诊断后4～6个月，5年生存率仅为5%[2]。掌握胰腺癌发生、发展的分子生物学机制并针对特定通路进行治疗的手段，为胰腺癌的早期诊断以及治疗提供有益的线索尤为重要。

我们通过运用免疫组织化学染色及PCR方法分别检测46例胰腺癌组织标本中葡萄糖转运蛋白-1(Glut1)的表达和Kras(Kirsten rat sarcoma viraloncogene homolog)基因突变，分析两者之间的相关性，在分子水平上初步探讨胰腺癌发生发展的机制，为胰腺癌的早期诊断及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

来自江阴市人民医院2005年1月至2014年12月间经外科手术切除的胰腺癌组织石蜡标本，共46例。所有病例资料完整，均经病理组织学确诊，按照胰腺癌TNM分期标准进行分期[3]。其中男25例，女21例；年龄37～84岁，中位年龄66岁；高分化腺癌(Ⅰ级)10例，中分化腺癌(Ⅱ级)21例，低分化腺癌(Ⅲ级)15例；发生淋巴结转移15例。病理分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期21例。同时切取癌旁的胰腺组织标本作为正常胰腺组织对照。

1.2 主要试剂

兔抗人Glut1多克隆抗体(南京巴傲得生物科技有限公司)，免疫组化EliVision plus试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，人类Kras基因突变检测试剂盒(苏州科贝生物技术有限公司)。

1.3 胰腺癌组织及正常组织中Glut1免疫组化检测

(1) 采用免疫组化S-P法，参照EliVision plus试剂盒说明书进行，具体如下：取胰腺癌组织，连续石蜡切片，60 ℃烘烤2 h，二甲苯脱蜡，然后水化，0.5%过碘酸处理后，予PBS冲洗；接着浸入柠檬酸缓冲液修复液加热，再用PBS冲洗；滴加3%双氧水，再次PBS冲洗；最后滴加正常山羊血清封闭液；滴加Glut1多克隆抗体一抗50 μl(稀释度1∶250)，放入4℃冰箱过夜；第2天复温，PBS冲洗，并依次滴加生物素标化二抗，辣根过氧化物酶标记链霉卵白素溶液，PBS冲洗；最后DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，中性树脂封片，镜下查看切片。每组切片均以PBS代替一抗作为阴性对照，其他步骤同前。

(2) 免疫组化结果判断：Glut1阳性表达定位于细胞膜和(或)细胞质。按肿瘤细胞阳性比率评分：0分，没有细胞着色；1分，肿瘤细胞阳性率≤5%；2分，肿瘤细胞阳性率6%～14%；3分，肿瘤细胞阳性率15%～30%；4分，肿瘤细胞阳性率>30%。按肿瘤细胞着色强弱评分：0分，没有细胞着色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。肿瘤细胞阳性率评分+肿瘤细胞着色强弱评分作为最终评分。根据最终评分，将Glut1染色分为4个等级：0-1分为阴性(0)，2-3分为弱阳性(1+)，4-6分为阳性(2+)，>6分为强阳性(3+)。片内正常胰腺组织及间质细胞无着色，作为阴性对照。

1.4 PCR检测胰腺癌组织中Kras突变基因的表达

(1) 基因组DNA抽提：采用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)提取组织DNA，常规切片厚4 μm 5～10张，经脱蜡、蛋白酶K消化及离心，将DNA洗脱。将DNA稀释，稀释至质量浓度为100 ng·μl-1，体积为50 μl。1张用于HE染色观察形态，其余用于下一步提取DNA；显微镜下观察HE切片，选取富于肿瘤细胞的区域，对应HE切片将肿瘤组织刮入裂解液，保证肿瘤成分80%以上。

(2) PCR法扩增Kras基因第2号外显子：根据Kras基因组DNA序列设计PCR引物，Kras基因第2号外显子上游引物为KRAS F1(GCCTGCTGAAAATGACTGAA)和KRAS F2(AAGGCCTGCTGAAAATGACTG)，下游引物为KRAS R1 (GTATCGTCAAGGCACTCTTGC)和KRAS R2 (AGAATGGTCCTGCACCAGTAA)。PCR反应体系20 μl，反应条件如下： 95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共45个循环;72 ℃延伸2 min，至40 ℃结束。以双蒸水代替DNA模板作为阴性对照，已知阳性病例作为阳性对照。取PCR扩增产物5 μl，2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色。

(3) DNA测序：将DNA PCR产物(20 μl)磁珠纯化，配制测序反应体系，总反应体积5 μl，盖紧PCR 管，用手指弹管混匀，稍离心后，将PCR 管置于PCR 仪上进行扩增。反应产物醋酸钠纯化后，上ABl3730 DNA Analyzer进行PAGE电泳。采用Sequence Analysis 软件进行序列分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，Glut1表达、Kras突变与各临床指标的关系之间比较采用卡方检验，Glut1表达与Kras突变的相关性用Spearman法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Glut1在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达结果

46例胰腺癌组织中，Glut1棕黄色或棕褐色阳性染色颗粒位于细胞质和(或)细胞膜，主要定位于细胞膜，阳性表达率为86.9%(40/46)，正常胰腺组织中无阳性表达(表1、图1)，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 Glut1 在胰腺组织中的表达

2.2 Kras在胰腺癌中的突变情况

46例胰腺癌患者中有26例患者存在Kras基因突变(56.5%)，其中24例12密码子突变(G34D 3例，G35D 21例),2例13密码子突变(G38D 1例，C39D 1例)。

2.3 胰腺癌中Glut1蛋白表达及Kras基因突变与胰腺癌临床病理特征的关系

胰腺癌组织中Glut1表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤部位具有显著相关性，差异具有统计学意义(P<0.05)。Kras的突变与肿瘤大小和神经侵犯相关，差异具有统计学意义 (P<0.05)。见表2。

2.4 胰腺癌中Glut1蛋白表达与Kras基因突变的相关性

在Glut1阳性表达的标本中，随着Glut1染色评分的递增，KRAS基因的突变率明显增加，差异具有统计学意义(r=0.99，P<0.05)。见表3。

3 讨 论

Kras基因是Ras原癌基因家族的一员，其表达与细胞生长及分化密切相关[4]。以往研究证实，超过90%的胰腺癌都存在Kras基因的点突变[5]。在胰腺癌中，单氨基酸置换G12、G13或Q61导致K-ras GTP水解活性失活，而且降低了对GAP的敏感性，从而导致磷酸化的K-ras持续聚积，与下游效应分子结合，导致了细胞的恶性转化[6]。Glut1是分布最广泛的葡萄糖转运蛋白，是一种膜性易化葡萄糖转运蛋白，它的功能是运输葡萄糖进入上皮细胞及促进细胞的代谢[7]，它的表达强弱与肿瘤恶性程度有关[8]。

A.正常胰腺组织中Glut1表达为阴性，标记为(-)(×100)； B.胰腺癌组织中Glut1阴性表达，标记为(-)(×200)； C.胰腺癌组织中的Glut1的弱阳性表达，标记为(1+)，(×200)； D.胰腺癌组织中的Glut1的中度阳性表达，标记为(2+)(×200)； E.胰腺癌组织中Glut1强阳性表达，标记为(3+)(×200)

图1 免疫组化检测Glut1在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达

表2 Glut1表达及Kras突变与患者临床病理特征的关系

表3 Glut1表达与Kras突变之间的相关性

Spearman’s rank test法：r=0.99，P=0.033

在低糖环境下Kras野生型细胞很难存活，而存活下来的Kras突变型细胞中Glut1高表达，且其中4%发生亲代未出现过的Kras突变[9]。进一步研究表明，Kras基因突变与Glut1表达在肺癌组织中也存在一定的的相关性[10]。两者关系在胰腺癌组织中是否相关，目前还没有相应的临床研究。鉴于此，我们以胰腺癌组织为标本，检测了46例癌组织切片中Glut1的表达及Kras的突变，结果显示胰腺癌中Kras基因突变率为56.5%，主要是12位点突变。而Glut1蛋白阳性表达率为86.9%，对应癌旁组织基本无表达，且其与Kras突变率呈正相关，提示KRAS基因突变可上调Glut1的表达。

在胰腺癌治疗中以Kras突变的靶向治疗方案并没有取得令人惊喜的研究进展[11-12]。因此，我们便进一步探讨针对细胞Kras基因的下游靶点的疗法研究。PET/CT是胰腺癌的可靠而有效的诊断方法[13]，而利用氟代脱氧葡萄糖(FDG)可以动态监测肿瘤细胞葡萄糖吸收。目前，抗肿瘤细胞能量代谢正成为抗肿瘤治疗的研究热点。与正常细胞不同，肿瘤细胞即使在供氧充足的情况下，葡萄糖依旧向乳酸转换，这种代谢称为有氧酵解或“Warburg效应”。研究发现，缺氧可诱导卵巢癌和肺癌细胞FDG摄入量增加，并可通过低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)HIF-Ia上调Glut1的表达，促进肿瘤细胞糖代谢。

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癌基因Ras的突变或者过表达常见于恶性肿瘤，通过介导HIF表达，来促进糖酵解。在应用诱导Kras G12位点突变建立的胰腺癌小鼠模型中，Kras G12位点突变在控制肿瘤代谢中作用很大，主要通过刺激葡萄糖摄取，驱动糖酵解，促进肿瘤发生发展[14]。已有研究结果[15]证实，针对糖酵解过程的肿瘤治疗手段是可行的。Kras突变与Glut1存在一定的相关性[16-17]。因此，我们猜想胰腺癌细胞Glut1的高表达可能与肿瘤在低氧环境下Kras基因的突变介导HIF的高表达有关，但是仍需要大量后续研究去证实。靶向Glut1及糖酵解治疗胰腺癌也不失可作为Kras分子靶向治疗的新手段，且具有良好的应用前景。

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Synergy of tumorigenesis between high-Glut1 expression and Kras mutation in pancreatic cancer

WU Dan1，WANG Cai-lian2,LI Chun-yan3，ZHENG Shi-ya2

(1.DepartmentofOncology，theAffiliatedJiangyinHospitalofSoutheastUniversityMedicalCollege，Jiangyin214400，China; 2.DepartmentofOncology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China； 3.NanjinMedicalUniversity，Nanjing210029，China)

Objective: To analyze the relationship between overexpression of Glut1 and Kras mutations in pancreatic cancer.Methods:In 46 cases of pancreatic carcinoma and 46 cases of tumor adjacent normal pancreatic tissues，immunohistochemistry was performed for Glut1 expression status. Kras mutation status was also evaluated using PCR-based assays.Results:Glut1 expression was increased in 40(86.9%) pancreatic cancer cases. At the same time ，it was not expressed in adjacent controls (P<0.001).The Glut1 overexpression was significantly associated with age(<56，62.5%vs>56，92.1%，P<0.05)，tumor size(<6 cm，92.1%vs>6 cm，62.5%，P<0.05)，tumor location(head，100%vsnon-head，71.4%，P<0.01)，Kras mutation was found in 26 (56.5%) pancreatic cancer cases. The Kras mutation was associated with tumor size(<6 cm, 63.2%vs>6 cm, 25%，P<0.05)，nerve invasion (absent，51.3%vspresent，88.9%，P<0.05). The Glut1 overexpression status was significantly correlated with Kras mutation status (r=0.99，P<0.05).Conclusion:Our results strongly suggest that overexpression of Glut1 is significantly correlated with Kras mutations in pancreatic cancer to increase the tumor genesis．

pancreatic cancer; glucose transporter isoform 1; Kras; glycolysis

2015-09-22

2015-10-14

吴丹(1978-)，女，江苏江阴人，主治医师。E-mail:wudan96121@163.com

吴丹，王彩莲，李春妍，等.胰腺癌Kras基因突变与Glut1高表达协同促进肿瘤发生[J].东南大学学报：医学版，2015，34(6)：982-986.

R735.9

A

1671-6264(2015)06-0982-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.06．028