戴婉如，周 欢，林燕辉，伍严安(福建医科大学省立临床医学院检验科，福州 300001)



免疫透射比浊法在AU5800全自动生化分析仪检测降钙素原的方法学评价

戴婉如，周 欢，林燕辉，伍严安(福建医科大学省立临床医学院检验科，福州 300001)

目的 在AU5800全自动生化分析仪上用免疫透射比浊法检测降钙素原(PCT)的方法学评价。方法通过AU5800全自动生化分析仪来检测PCT的精密度、线性、参考区间等指标，并与酶免疫荧光法试剂盒进行相关性比较，从而评价其性能。结果 该方法批内和批间精密度分别小于8%和15%；0～80 ng/mL范围内线性良好(Y=0.994 1X+0.124 5，R2=0.999)；正常人群的参考范围为小于0.5 ng/mL；与酶免疫荧光法的相关性良好(Y=0.357 4X+0.284 2，R2=0.960 7)。结论 本检测方法不仅实现了PCT检测的快速、全自动化，而且化学性能优良、操作简单，降低了临床试剂成本，适合临床推广使用。

降钙素原； 免疫比浊法； 方法学评价； 免疫荧光法

降钙素原(PCT)在临床主要应用于感染性疾病的鉴别[1]，是诊断血行感染、菌血症、败血症的一个较好指标[2-3]。目前PCT的检测方法主要有放射免疫法、双抗体夹心法、胶体金法、免疫荧光法、免疫透射比浊法等。本研究选用的国产免疫透射比浊法，具有快速、简便，且价格相对较低廉的特点。根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)和医学实验室认可标准(ISO15189)对实验室质量的要求[4]，实验室对检测系统(仪器、试剂、校准品等)必须进行性能验证[5]。因此，实验室需要对厂商声明的主要分析性能进行验证。本文对AU5800检测系统测定PCT进行精密度、线性范围、参考区间等指标的方法学评价，再与酶免疫荧光法检测结果进行比对，观察结果相关性，以此来评价该检测方法在临床上的价值。

1 材料与方法

1.1 材料来源 患者标本为2013年10～11月实验室接收的67例临床送检标本。酶免疫荧光法随时检测送检标本，剩余血清-80 ℃保存用于免疫比浊法测试(一次性完成)。正常人群均为健康体检者，年龄16～77岁，选择血常规、C反应蛋白(CRP)正常，即无急、慢性炎症的体检合格标本20例。

1.2 仪器与试剂 贝克曼AU5800全自动生化分析仪，梅里埃全自动荧光分析仪。安徽大千生物工程有限公司生产的PCT测定试剂盒(免疫透射比浊法)(批号085813)，标准品(批号084113)和质控品(批号084213)。梅里埃诊断产品(上海)有限公司进口的PCT测定试剂盒(酶免疫荧光法)(批号1002326640)，校准品(批号1057790)和质控品(批号1057880)。

1.3 方法

1.3.1 免疫透射比浊法 样品中的PCT与试剂中的PCT抗体发生抗原-抗体反应，形成复合物，从而引起透光度减低，在一定范围内与样本中PCT量呈线性相关。

1.3.2 酶免疫荧光法 结合一步免疫测定夹心法和最终荧光检测来进行测定。

1.4 评价标准

1.4.1 精密度评价 按照CLSI EP15-A2，取2个浓度水平质控品，5 d实验，每天做1批，每批每个水平3次重复测定，计算批内精密度和批间精密度的均值、标准差和变异系数。

1.4.2 线性评价 选择低浓度(L)和高浓度(H)患者标本各1份，浓度覆盖仪器说明书给出的线性范围，H和L按等比关系配制形成系列浓度血清(如1L，0.8L+0.2H，0.6L+0.4H，0.4L+0.6H，0.2L+0.8H，1H)。每个实验样品在检测系统上重复测定2次，记录结果。将实测值与预期值作比较。采取平均斜率来确定系列样品应含有的待测物的预期值(X)，所有样品重复测定的均值为实测值(Y)，将所有结果点在X-Y坐标图上，计算回归方程:Y=bX+a和R2，并用t检验验证a是否与0差异有统计学意义。

1.4.3 参考区间评价 参考NCCLSC28-A2文件，选择20份体检合格的健康人标本，在检测系统上进行测定，对结果进行统计并对仪器说明书提供的参考区间进行验证，若20份标本检测结果均在仪器说明书提供的参考区间内或仅有2个标本超出，则验证通过。否则，进行参考区间确立实验。

1.4.5 相关性评价 通过67例不同病例分别用酶免疫荧光法和免疫透射比浊法测定，比较两者的相关性。

1.5 统计学处理 实验数据采用SPSS13.0软件和Microsoft Excel 2000软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCT精密度结果 精密度评价结果符合厂家声明的批内精密度CV≤8.0%、批间精密度CV≤15.0%。该检测系统的批内精密度和批间精密度均满足检测要求。见表1。

表1 PCT的精密度

2.2 线性结果R2=0.999，b=0.994 1，1.03≥b≥0.97；a=0.124 5，经t检验t=0.371，小于t0.05=2.228，显示a与0差异无统计学意义(P>0.05)。验证结果表明PCT在0～58.8 ng/mL范围内具有良好线性关系，与厂家提供线性范围0～80 ng/mL相符合。见表3和图1。

表3 6个稀释浓度标本PCT结果(ng/mL)

注:X为各组数据的理论值，Y为各组实测值减去“1”号实测均值后的数值(实测值)。

图1 PCT的线性测定

2.3 参考区间的验证 参考NCCLSC28-A2文件，选择20份体检合格的健康人血清标本，在检测系统上进行测定。经验证20份健康人血清标本浓度均在仪器说明书提供的参考区间内，符合试剂说明书提供参考范围，无结果超出所验证的参考范围，参考范围通过验证，表明正常人群PCT参考范围为小于0.5 ng/mL。

2.4 相关性实验 取67例标本同时用酶免疫荧光法和免疫透射比浊法测定，结果表明两者相关性良好，Y=0.357 4X+0.284 2，R2=0.960 7。见图2。

图2 免疫比浊法和免疫荧光法检测PCT结果比对

3 讨 论

根据医学实验室认可标准(ISO15189)对实验室质量的要求，实验室对检测系统(仪器、试剂、校准品等)必须进行验证。对试剂验证包括：精密度、线性、准确度和参考范围等[6]。

精密度评价按照CLSI EP15-A2文件进行，实验数据显示在AU5800全自动生化分析仪上PCT测定的精密度达到了厂家检测声明，批内和批间精密度分别小于8%和15%。线性评价即分析测量范围评价根据EP6-A文件，采用简便的平均斜率法。在AU5800全自动生化分析仪上PCT的浓度在0～58.8 ng/mL范围内具有良好线性关系，由于PCT达到80 ng/mL的血清标本难以获得，最高检测限58.8 ng/mL偏低于厂家的最高测定值，有待于进一步验证。参考区间的验证参考NCCLSC28-A2文件，选择20份体检合格的健康人血清标本全部通过验证。与法国梅里埃诊断产品(上海)有限公司进口的PCT测定试剂盒(酶免疫荧光法)进行相关性实验，表明PCT免疫比浊法结果同样可靠(n=67，R2=0.960 7)。

目前检测PCT的方法很多[7]。传统的放射免疫法敏感性较高，但检测时间较长，且有放射性元素污染，使用受限；胶体金法为半定量法，不依赖仪器，操作简便快速，但敏感性低，线性范围小无法满足临床需求，只能作为临床筛查；免疫发光法具有敏感度高、特异性强等特点，但是成本昂贵，不利于临床推广[8]。临床需要一种快捷、准确、成本相对低廉的PCT测定方法，以便于临床广泛推广应用。免疫比浊法简便、快捷，适用于波长包括600 nm的各种生化分析仪，可满足临床急诊及批量检测的需要；而且成本较低，可以大大减低患者的检测费用。

综上所述，免疫比浊法检测PCT的各项性能指标进行验证和评价，均能满足临床检测的要求，具有良好的发展前景。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.049

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1672-9455(2015)10-1447-02

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