周正丽，汤华军，王 云(泸州医学院人体解剖学教研室，四川泸州 646000)



甲酸混合酸脱钙液在兔股骨头制片中的应用*

周正丽，汤华军，王 云(泸州医学院人体解剖学教研室，四川泸州 646000)

目的 观察甲酸混合酸脱钙液对股骨头组织的制片效果。方法 采用成年新西兰大白兔10只，切断股骨头圆韧带，取股骨上1/3段置于甲酸混合酸脱钙液中脱钙1周，随即常规脱水、透明、石蜡包埋，制备5 μm厚纵切片，行HE染色。结果 所有组织切片厚薄均匀，未见脱片现象，股骨头完整性较好，各层次分明，骨小梁结构完整，软骨细胞、骨细胞细胞形态清晰，着色鲜艳。结论 选用甲酸混合酸脱钙液制片股骨头组织具有脱钙时间相对较短、操作简单、组织结构完整、染色效果较好的特点。

股骨头； 兔； 脱钙

股骨头坏死是骨关节外科常见难疾，动物模型实验研究是当前股骨头坏死研究的热点之一[1-2]，通过组织病理切片评估股骨头病变的进程是股骨头坏死检查的金标准，而股骨头组织由于其硬度较大，易脱片、易破碎、染色不佳等常使制片效果不尽如人意，其中脱钙液的选择是影响制片效果的关键。故本文选择股骨头坏死常备实验动物--经济实用性健康兔为制片对象，拟采用甲酸混合酸脱钙液制作切片以观察其制片效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年新西兰大白兔10只，雌雄不拘，体质量2.0～2.5 kg，由泸州医学院实验动物中心提供，本研究所采用的动物实验操作程序符合动物实验相关伦理要求。

1.2 主要试剂与仪器 试剂包括生理盐水、戊巴比妥钠、甲酸、浓盐酸、三氯化铝、甲醛、石蜡、苏木精染液、伊红染液、甘油、二甲苯等。实验仪器磁力搅拌器(上海跃进医疗器械厂)，热恒温电烤箱(上海跃进医疗器械厂)，RM 2235石蜡切片机(Leica)，YS100光学显微镜(Nikon)，电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 取材 以3%戊巴比妥钠 30 mg/kg剂量耳缘静脉注射麻醉动物；依次切开皮肤、浅筋膜，钝性分离各层臀肌，切开髋关节囊，切断股骨头韧带，显露股骨头，选择骨干1/3处将股骨锯断，在低温冰块上迅速剔除股骨附着的肌肉及结缔组织，将其置于10%甲醛中固定48 h。

1.3.2 甲酸混合酸脱钙液的配置 取甲酸5 mL，浓盐酸8.5 mL，称量三氯化铝7 g，混匀后加蒸馏水定容至100 mL，现配现用。

1.3.3 股骨头组织切片的制作 将标本置于甲酸混合酸脱钙液中，磁力搅拌器搅拌混匀，静置脱钙1周，之后以大转子为中心，纵行剖开股骨头，常规脱水、透明，随即石蜡包埋，采用石蜡切片机制备5 μm厚纵切片，行HE染色。

2 结 果

所有组织切片厚薄均匀，无刀痕，均未见脱片现象，肉眼可见切片股骨头完整性较好，软骨区、骨小梁区、骺板区结构清晰，层次分明。光学显微镜下可见骨小梁结构完整，无折叠；软骨细胞、骨细胞细胞形态清晰可见，细胞核无明显收缩现象，细胞核与细胞质着色清晰，红蓝相间，色彩鲜艳；脂肪细胞、小血管等结构分明，色泽鲜明。见图1、2。

图1 软骨细胞，HE染色 40×10倍

图2 骨细胞及脂肪细胞，HE染色 40×10倍

3 讨 论

脱钙是指用物理或化学方法将骨组织标本中的有机组织和钙盐分离，通过去除钙盐和无机盐从而获得完整的胶原纤维组织，只有去除无机盐物质，才能使组织软化行切片染色观察[3]，可见股骨头组织制片脱钙液的选择是制片成功的关键。脱钙若不彻底，钙盐遗留，切片易破碎、残缺，影响制片的质量；脱钙过度，则脱钙液中的酸类物质又会损伤组织中的抗原，破坏组织细胞的形态结构，导致染色效果不佳。

目前，骨组织切片常选用的脱钙液包括以硝酸为主的酸性脱钙液和乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液。硝酸尽管具有脱钙能力强、时间短等优点，但易出现脱钙过度，细胞明显肿胀至使细胞结构不完整，细胞核染色能力减弱，返蓝困难而至细胞核呈淡红色，对比度明显降低[4]。EDTA是一种优良的脱钙螯合剂，对组织破坏极小，能保持组织细胞的完整结构，尤其细胞显微化学改变甚微，且能保存组织中的抗原物质和某些酶类的活性，但EDTA脱钙液脱钙作用较缓慢，短者数周常者数月，不适用于大面积骨组织脱钙[5]。

本研究选用甲酸混合酸脱钙液辅以三氯化铝，其中甲酸对组织的破坏程度较轻，脱钙时间范围宽松；盐酸可明显增加脱钙速度，而且对组织具有收缩作用；三氯化铝的加入，铝离子易被吸附的特性可以起到保护剂的作用，从而减缓盐酸对细胞核着色的影响，同时它又是HE染色苏木精的媒染助染剂，可辅助得到优良的染色效果。且甲酸混合酸脱钙液脱钙时间仅1周，脱钙中间不换液，不水洗，组织损伤较少，即可保证脱钙彻底，又可使各结构层次不分离，取得良好的染色效果。此外，还发现脱钙后充分水洗也是影响制片成功的因素之一，组织脱钙后经流动的自来水充分冲洗，自来水的弱碱性可中和残留在组织中的脱钙液酸性，有利于切片的苏木素着色。

综上所述，甲酸混合酸脱钙液辅以三氯化铝对骨组织标本脱钙有一定的优越性，值得在临床实验中使用。

[1]Poignard A，Lebouvier A，Cavet MA，et al.New preclinical porcine model of femoral head osteonecrosis to test mesenchymal stromal cell efficiency in regenerative medicine[J].Int Orthop，2014，38(9):1837-1844.

[2]Hwang Y，Park J，Choi SH，et al.Traumatic and Non-traumatic osteonecrosis in the Femoral Head of a Rabbit Model[J].Laboratory Animal Research，2011，27(2):127-131.

[3]戚亦萍，吴明媛，王明海，等．兔膝关节炎骨关节组织切片的制备方法[J]．上海交通大学学报:农业科学版，2009，27(3)：314-317．

[4]罗灿峤，莫木琼，钟觉民．不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用[J]．中国实用医药，2011，6(19)：27-28．

[5]沈溪明，何欣欣，吴东霞，等．不同浓度和pH值EDTA脱钙液对下颌骨免疫组化结果的影响[J]．临床与实验病理学杂志，2014，30(6)：696-698．

泸州医学院校级课题 (2013ZRQN073)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.038

A

1672-9455(2015)10-1426-01

2014-11-05

2015-02-05)