邱厚匡，姚亚超，李 磊，李亚红，张 珍，李 楠，严 芳，李泽泳，吴春燕，吴晓昀，张 智△(.广东省第二人民医院中心实验室，广州 5037；.广州医科大学附属第三医院生殖医学中心/广东省生殖医学重点实验室，广州 5050)



·论 著·

EB病毒抗体及其DNA联合检测在鼻咽癌筛查和早期诊断中的价值*

邱厚匡1，姚亚超1，李 磊2，李亚红1，张 珍1，李 楠1，严 芳1，李泽泳1，吴春燕1，吴晓昀1，张 智1△(1.广东省第二人民医院中心实验室，广州 510317；2.广州医科大学附属第三医院生殖医学中心/广东省生殖医学重点实验室，广州 510150)

目的 探讨EB病毒(EBV)抗体及EBV DNA联合检测在鼻咽癌筛查和早期诊断中的价值。方法 收集2011年7月至2014年8月广东省第二人民医院经病理确诊的鼻咽癌患者272例，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清RTA-IgG、VCA-IgA和EA-IgA；荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定血浆EBV-DNA。结果 四项指标联合检测时，其敏感度最高(99.63%)；早期鼻咽癌的阳性率为97.62% (41/42)，晚期鼻咽癌的阳性率为100.00% (230/230)。四项指标中任意两项及两项以上指标为阳性的特异性在93.00%以上。结论 四项指标联合检测可用于早期鼻咽癌的筛查，任意两项以上指标阳性时应高度怀疑鼻咽癌。

鼻咽癌； EB病毒抗体； EBV DNA； 早期诊断

鼻咽癌(NPC)是侵袭性和转移率最高的头颈部恶性肿瘤，在中国华南和东南亚地区高发[1]，很多患者确诊时已为晚期，预后较差[2]。早期鼻咽癌预后较好，但其位置隐蔽，早期症状不明显，因此对鼻咽癌高发地区人群进行筛查和早期诊断是治疗鼻咽癌的关键[3]。大量研究表明EB病毒(EBV)与鼻咽癌的发生发展密切相关[4]，EBV相关抗体和EBV DNA是目前诊断鼻咽癌的重要方法[5-6]。目前尚无联合检测RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA、EBV DNA对鼻咽癌早期诊断价值的报道。本研究旨在探讨联合检测这四项指标在鼻咽癌筛查和早期诊断中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年7月至2014年8月广东省第二人民医院经病理确诊的鼻咽癌患者272例，其中男195例，女77例；年龄21～80岁，中位年龄48岁。所有患者均按鼻咽癌临床TNM分期法进行分期，Ⅰ、Ⅱ期为早期，Ⅲ、Ⅳ期为晚期，病理类型以非角化型癌为主，占93.38%(254/272)。

1.2 抗体检测方法 抽取鼻咽癌患者治疗前静脉血5 mL。RTA-IgG抗体检测采用北京同昕生物技术有限公司的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)试剂盒，VCA-IgA和EA-IgA抗体检测采用德国欧蒙医学实验诊断股份公司的ELISA试剂盒。严格按照上述试剂盒的说明书进行操作，RTA-IgG以S/CO≥1.0为阳性，VCA-IgA和EA-IgA均以S/CO≥1.1为阳性。

1.3 EBV DNA检测方法 分离乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血血浆，DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。荧光定量聚合酶链反应(PCR)法测定EBV DNA，计算病毒拷贝数，检测试剂购自湖南圣湘生物科技有限公司。EBV DNA>50 copy/mL记为阳性，低于检测下限记为阴性。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验；以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EBV四项检测指标对鼻咽癌的诊断价值 单独应用一项指标检测鼻咽癌患者时，以VCA-IgA敏感度最高(96.32%)，EA-IgA特异性最高(94.68%)。见表1。四项指标联合检测时，至少一项检测结果为阳性者的敏感度最高(99.63%)，仅有1例鼻咽癌患者漏诊。两项指标联合检测时，RTA-IgG和VCA-IgA均为阳性的约登指数最高(83.13%)，RTA-IgG和EA-IgA均为阳性的特异性最高(100.00%)。任意三项或四项检测均为阳性的特异性也可达到100.00%。四项指标中任意两项及两项以上指标为阳性的特异性均在97.00%以上。见表2。

2.2 不同临床分期鼻咽癌患者EBV检测指标阳性率比较 各期病例中RTA-IgG、VCA-IgA和EA-IgA阳性率之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；EBV DNA阳性率在各鼻咽癌分期之间差异均有统计学意义(P<0.01)。单项检测时，早期鼻咽癌患者中RTA-IgG和VCA-IgA的阳性率分别为85.71% (36/42)和88.10%(37/42)；晚期鼻咽癌患者中VCA-IgA的阳性率最高，可达到97.83%(225/230)。联合检测时，早期和晚期鼻咽癌中至少一项检测结果为阳性的概率分别为97.62%(41/42)和100.00%(230/230)。见表3。

表1 EBV四项检测指标对鼻咽癌的诊断价值[%(n/n)]

表2 不同指标联合检测对鼻咽癌的诊断价值

表3 不同临床分期鼻咽癌患者EBV检测指标阳性率比较[%(n/n)]

3 讨 论

大量研究表明EBV感染与鼻咽癌的发生发展密切相关，EBV相关抗体如RTA-IgG，VCA-IgA和EA-IgA等可作为鼻咽癌辅助诊断的血清学指标[7-8]。此外，鼻咽癌患者血浆中存在高拷贝数的EBV DNA，且其水平变化与肿瘤发生、疗效、复发和转移等多个环节相关[9]。血清学指标改变和EBV DNA拷贝数的改变在鼻咽癌发生发展中是普遍和早期的事件，因此探讨早期鼻咽癌血清学和EBV DNA改变情况，将有助于实现鼻咽癌的早期诊断，从而提高鼻咽癌治愈率。

本研究结果显示，单项检测RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA和EBV DNA时，其敏感度分别为87.50%、96.32%、57.35%和72.43%；RTA-IgG，VCA-IgA和EBV DNA的敏感度与以往报道一致，EA-IgA的敏感度与以往报道不一致[10-11]，分析原因可能是所用检测方法、检测试剂盒、阳性判断标准的差异和纳入人群的地域分布不一致等。本研究采用德国欧蒙医学实验诊断股份公司的ELISA试剂盒，而其他研究多采用中山生物工程公司的免疫酶法检测试剂盒[11-14]。此外，单项检测时以VCA-IgA的敏感度最高，EA-IgA的特异性最高，与罗耀凌等[14]报道的结果一致。

临床分期是影响鼻咽癌预后的主要因素。RTA-IgG、VCA-IgA、EA-IgA在鼻咽癌的各个临床分期之间阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与以往报道一致[11]。提示这三项指标不适用于判定鼻咽癌临床分期。本研究中EBV DNA阳性率随着临床分期升高而增加，与以往报道一致[13]。在鼻咽癌早期，RTA-IgG或VCA-IgA单项指标诊断鼻咽癌的阳性率相差不大，分别为85.71%和88.10%，但是尚不足以成为理想的鼻咽癌早期筛查的肿瘤血清学指标。

RTA蛋白是EBV由潜伏期转向裂解期的关键调控因子，它能引起一系列裂解早期基因的相继表达，最终引发EBV裂解干扰[15-16]。VCA是在鼻咽癌增殖后期形成的结构蛋白，是在感染EBV后最晚表达的一种抗原，可在体内终生存在，有助于早期诊断鼻咽癌[7-8]。EA-IgA虽然也是鼻咽癌增殖后期形成的结构蛋白，但是其刺激机体产生免疫应答的情况存在个体差异，所以其敏感度不高，但是却有较高的特异性[7-8]。EBV DNA是反映肿瘤消长情况灵敏可靠的指标，可用于鼻咽癌的诊断、疗效评价和预后评价[9]。

近年来，国内外有很多联合检测用于鼻咽癌筛查和诊断的报道，张玉等[17]认为VCA-IgA和EA-IgA联合检测，在鼻咽癌血清学诊断中具有互补作用，但敏感度仅有84.85%；汪欣等[18]认为，VCA-IgA、ZTA-IgA、NA1-IgA或者RTA-IgG、VCA-IgA、ZTA-IgA三项联合检测可使鼻咽癌检出率达到100.00%。但该研究中鼻咽癌患者例数仅有20例，不能准确反映这些指标诊断鼻咽癌的真实情况。本研究中采用四项检测指标，既包括EBV相关抗原的免疫应答情况，又含有鼻咽癌时EBV自身增殖情况，检测结果可以互补。研究结果显示，仅有1例早期鼻咽癌漏诊，早期鼻咽癌的阳性率可提高至97.62%(41/42)，晚期鼻咽癌的阳性率可达到100.00%，虽然其约登指数不高(58.14%)，但是可以提高临床筛查的敏感度。

已知EA-IgA诊断鼻咽癌的特异性较高，此指标阳性者鼻咽癌风险非常大，与其他指标同时阳性者的风险更大。本研究两项指标检测中RTA-IgG和EA-IgA均为阳性，任意三项或四项检测均为阳性的特异性均可达到100.00%，出现上述检测结果时应该高度怀疑鼻咽癌。郭丽萍等[19]报道EBV RTA-IgG和VCA-IgA两种抗体均为阳性者，可列为鼻咽癌高危人群。程伟民等[20]报道，EBNA1-IgA、EBNA1-IgG和ZTA-IgG均为阳性的特异性可达到93.00%。本研究中比较了四项指标中两项及以上指标的阳性率，与姜世强等[21]报道一致。DNA和VCA-IgA，以及EA-IgA和EBV DNA均为阳性时有较高的鼻咽癌诊断价值。本研究中任意两项以上指标为阳性时诊断鼻咽癌的特异性均在97.00%以上，可较以往报道获得更高的特异性，可提高临床诊断的准确度。若临床患者出现任意两项以上指标为阳性时，提示其鼻咽癌风险非常高，应高度怀疑鼻咽癌。

综上所述，本研究所采用的四项指标联合检测有互补作用，可用于鼻咽癌高发地区人群的筛查和早期诊断，其中一项阳性者应该定期复查体检，以便提高早期无症状鼻咽癌检出率；任意两项以上指标为阳性时，应高度怀疑鼻咽癌，实现早期无症状鼻咽癌的准确诊断。

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Combined determination of Epstein-Barr virus-related antibodies and EBV DNA for nasopharyngeal carcinoma early diagnosis*

QIUHou-kuang1，YAOYa-chao1，LILei2，LIYa-hong1，ZHAGNZhen1，LINan1，YANFang1，LIZe-yong1，WUChun-yan1，WUXiao-yun1，ZHANGZhi1△

(1.BiologicalExperimentCenter，theSecondPeople′sHospitalofGuangdongProvince，Guangzhou，Guangdong510317，China；2.DepartmentofReproductiveMedicineCenter/KeyLaboratoryforReproductiveMedicineofGuangdongProvince，ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou，Guangdong510150，China)

Objective To evaluate the values of combined detection of Epstein-Barr virus-related antibodies and EBV DNA for diagnosing of early stage nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods A total of 272 NPC patients were recruited in this study from July 2011 to August 2014 in the Second People′s Hospital of Guangdong Province.Euzymelinked immunosorbent assay was performed to detect RTA-IgG，VCA-IgA and EA-IgA antibody,and real-time fluorescent quantitative PCR for measuring EBV DNA in plasma.Results The sensitivity of the combined detection for diagnosing NPC was 99.63%.Combined detection could improve the positive rate of diagnosis for early and late stage NPC to 97.62% (41/42) and 100.00%(230/230) respectively.The positive rate of any two or more indicators for NPC was above 93.00%.Conclusion Combined determination could be helpful to screen the early stage NPC，when people has any two or more positive indicators should be suspected to have NPC.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr virus antibody; EBV DNA; early diagnosis

国家自然科学基金项目(81400639)；广州医科大学博士启动基金(2014C39)。

邱厚匡，男，本科，技师，主要从事分子生物学研究。

△通讯作者,E-mail：yalw135@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.10.001

A

1672-9455(2015)10-1339-03

2014-11-05

2015-01-15)