王金英，秦蜜蜜，韩影影，张 燕，曹 璋

（1.滨州医学院病理学教研室，山东滨州256603；2.东营市人民医院药剂科，山东东营257091）

白藜芦醇抑制结肠癌细胞系HT－29体外增殖作用的研究

王金英1，2，秦蜜蜜1，韩影影1，张 燕1，曹 璋1

（1.滨州医学院病理学教研室，山东滨州256603；2.东营市人民医院药剂科，山东东营257091）

目的通过观察白藜芦醇对结肠癌细胞系HT－29增殖的影响并检测程序性细胞死亡4蛋白表达水平，探讨白藜芦醇的抗结肠癌增殖作用及部分相关机制。方法HT－29细胞经不同浓度白藜芦醇作用后，流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡情况，Western blot法检测程序性细胞死亡4蛋白表达水平变化。结果不同浓度的白藜芦醇对HT－29细胞的增殖有抑制作用，并且呈现出一定的剂量依赖性（P＜0.01），白藜芦醇改变细胞周期分布，细胞周期阻滞在S期，同时诱导HT－29细胞凋亡，试验组与空白对照组相比，S期细胞比例及凋亡率明显增高（P＜0.05），细胞周期被阻滞，增殖抑制。白藜芦醇处理后HT－29细胞程序性细胞死亡4蛋白表达水平上调，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论白藜芦醇能够显著抑制HT－29细胞株的增殖，细胞周期阻滞于S期，诱导肿瘤细胞凋亡，其肿瘤抑制作用可能与程序性细胞死亡4蛋白表达上调有关。

白藜芦醇；HT－29；细胞增殖；程序性细胞死亡4

结直肠癌已经成为我国最常见的九大恶性肿瘤之一。随着对结直肠癌的研究，认为结直肠癌发生、发展是一个多步骤、多阶段的过程，在这一复杂的过程中受到多个基因的调控［1，2］。目前在临床治疗中，主要运用手术和放化疗的方案，但是预后往往较差。我国中医药资源丰富，从传统中医药中寻找抗肿瘤成分将有助于改善结直肠化疗疗效，提高肿瘤的综合疗效。

白藜芦醇（resveratrol，Res）是从植物毛叶黎芦的根部分离得到的一种重要的植物抗毒素，它是一种对植物本身具有保护作用的多酚类物质［3］。具有保护心血管、抗氧化、抗自由基、抗癌等多种生物学效应，可以预防和缓解包括肿瘤在内的许多疾病［4～7］。程序性细胞死亡4（Programmed cell death4，PDCD4）基因在细胞发生程序性死亡过程时诱导产生，是在小鼠体内研究时发现的与细胞凋亡相关的基因，人的PDCD4基因定位于10q24，但是其功能尚未很好的明确［8～11］。

本研究观察不同浓度的白藜芦醇对结肠癌细胞系HT－29的影响，检测细胞周期分布、增殖抑制情况及PDCD4的表达变化，以探讨白藜芦醇对结肠癌的抗癌作用及相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料 结肠癌细胞系HT－29（上海生命科学院细胞和生物化学研究所）；白藜芦醇（美国Sigma公司）；L15培养液（美国Gibicob公司）；二甲基亚砜（DMSO）（美国Biomol公司）；四甲基偶氮唑蓝（美国Sigma公司）；兔抗人PDCD4单克隆体（Epitomics公司）；HRP标记的山羊抗兔二抗（北京中杉公司）；CCK－8试剂盒（日本Dojindo公司）；兔抗人β－Actin多克隆抗体（北京中杉公司）；化学发光试剂（Western Blotting Luminol Reagent，美国Santa Cruz）；蛋白质分子量标准（华美生物工程公司）；X－光片（柯达公司）；定影液、显影液（碧云天生物科技公司）。

1.2 细胞培养 HT－29细胞用L15培养液（含10%的胎牛血清，100 U·mL－1链霉素，100 U·mL－1青霉素）在37℃、5%CO2的恒温培养箱中常规培养，用0.25%胰酶－EDTA消化传代。

1.3 CCK－8法检测 取对数生长期细胞，按照5 ×104／孔接种于96孔板上，培养12 h，细胞贴壁生长后，按照不同浓度梯度30、60、120μmol·L－1加入白藜芦醇（试验组），空白组加入等体积的培养基，对照组加入含DMSO的等体积培养基。分别设24、48 h作为试验终止时间点。不同浓度的白藜芦醇作用不同时间后的HT－29细胞培养液中加入20 μg·L－1CCK－8试剂（5 g·L－1），继续培养4 h，吸去上清液后置于空气振荡器上振荡10 min，以酶标仪测定光密度值（D450nm），计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率（%）＝（1－Res作用细胞D450nm／对照细胞D450nm）×100%

1.4 流式细胞仪检测细胞周期分布情况 加入白藜芦醇的HT－29细胞和未经白藜芦醇处理的HT－29细胞培养24 h，体积分数为0.25%胰酶消化、中和、离心、收集细胞。以PBS清洗3遍后，加入75%乙醇（冷）2 mL中固定，放置冰箱中，在4℃条件下过夜；再将细胞密度调整为5×105～1×106·L－1，PBS重悬2次后加PI染液1 mL，避光放置15 min，最后用流式细胞仪检测。用CellQuent软件对结果进行数据分析，分别读取试验组（120μmol·L－1白藜芦醇）和对照组（未加白藜芦醇）G0／G1期、S期和G2／M期细胞的百分比，上述试验至少重复3次，并取平均数进行统计分析。

1.5 Western blot法检测细胞PDCD4蛋白表达水平 取对数生长期的HT－29细胞，加入不同浓度的白藜芦醇培养24 h后用细胞刮尺收集细胞，裂解后再对细胞的总蛋白质进行提取，采用BCA法测定各组细胞蛋白浓度。取总蛋白量为30μg的蛋白裂解液经SDS－PAGE恒压电泳150 V，90 min后转移到硝酸纤维素膜上，用TBST清洗3次，加入兔抗人PDCD4抗体（1∶2 000）、GAPDH抗体（1∶4 000），4℃过夜；HRP标记的山羊抗兔的抗体为二抗，室温孵育3 h。通过凝胶成像分析系统扫描成像，图像分析软件Bandscan 5.0扫描杂交条带的相对光密度值获得PDCD4蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 不同浓度白藜芦醇对结肠癌细胞系HT－29增殖抑制的影响 CCK－8试验结果显示在经不同浓度的白藜芦醇作用24、48 h后，HT－29细胞增殖受到抑制，并且这种抑制作用具有剂量依赖性。同一时间点各实验组OD值与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），结果见表1。

表1 不同浓度白藜芦醇对HT－29细胞系的抑制率（%）

2.2 白藜芦醇对细胞周期分布及凋亡的影响 白藜芦醇处理后24 h，能诱导HT－29细胞产生凋亡，并呈剂量依赖性。与空白对照组比较，细胞凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表2、图1。

2.3 白藜芦醇对HT－29细胞PDCD4蛋白表达的影响 与空白对照组比较，不同浓度白藜芦醇作用HT－29细胞24 h后，PDCD4蛋白的表达增加，且随着药物浓度增加有明显增强的趋势，见图2。

表2 白藜芦醇对结肠癌细胞系HT－29作用24 h后细胞周期比较

图1 白藜芦醇对HT－29细胞周期分布的影响

图2 白藜芦醇对PDCD4蛋白表达水平的影响

3 讨论

结肠癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，结肠癌的发生、发展是一个复杂的过程，受多种因素影响，且过程涉及多个环节的复杂转变。它包括多种细胞信号转导通路的异常、癌基因的激活以及肿瘤抑制基因的失活。

我国中草药资源丰富，从天然产物中寻找抗肿瘤活性成分是抗肿瘤药物研发的重要途径之一。临床广泛应用的一些抗肿瘤药物都是从这一途径获得，如来源于植物的紫杉醇、喜树碱、鬼臼毒素及长春新碱等抗肿瘤药物已经被批准上市并获得了肯定的效果。白藜芦醇是葡萄和红酒中的一种备受关注的天然产物，之前的研究发现这种酚类衍生物在糖尿病及肥胖症的预防、改善方面可能发挥了重要作用。近年来其抗癌作用备受关注，对癌症的起始、促进、发展3个阶段均有明显的抑制作用。

本试验结果显示，白藜芦醇可以抑制结肠癌细胞系HT－29的增殖，且抑制作用呈现一定的剂量和时间依赖性。在细胞周期分布上，经白藜芦醇作用后的结肠癌细胞系HT－29主要阻滞在S期及G2期。白藜芦醇通过影响相关的周期素依赖激酶、蛋白激酶、抑制因子的活性来对正常细胞周期的运行产生干扰，使结肠癌细胞发生G2期和S期阻滞。有研究报道肠癌细胞HCT－116经白藜芦醇作用后，出现线粒体膜破裂以及细胞凋亡，但是细胞的线粒体膜破裂出现较晚，凋亡幅度也小，这说明还可通过使得家族非依赖性线粒体损伤而诱导肿瘤细胞的凋亡［10］。也有研究显示白藜芦醇是通过抑制p34（CDC2）激酶和CDK7激酶实现G2期的阻滞［11］。白藜芦醇可以通过抑制CDK2和CDK4活性，使得CyclinD1和p21的表达显著增加，使多种肿瘤细胞停止于S期［12］。本研究对HT－29细胞用不同浓度的白藜芦醇干预后，从细胞周期的分布结果来看，HT－29细胞主要阻滞在S期，抑制了DNA合成，从而抑制HT－29细胞的生长，研究结果与上述报道基本一致。

细胞凋亡是多细胞生物中去除体内异常的或者不需要的细胞的一种基本生物学现象，在生物体的进化、内环境的稳定中起着重要的作用，具有重要的生物学意义，其调控机制也是一复杂的分子生物学机制。本研究结果显示，对HT－29细胞用不同浓度的白藜芦醇干预后，可以诱导HT－29细胞产生凋亡，研究结果与其他实验室研究结果相近，Delmas等［9～12］报道白藜芦醇具有通过caspase激活而促进人结肠癌细胞SW480诱导凋亡。凋亡是多基因严格控制的过程，程序性细胞死亡4基因与细胞凋亡有关的基因，在细胞发生程序性死亡时诱导产生。PDCD4在转录和翻译水平调控多个与肿瘤进展、细胞周期和细胞分化相关的蛋白的表达。PDCD4可引起AP－1转录活性的降低以及诱导p21／Cip1的表达，从而降低细胞的增殖。本试验结果显示，经不同浓度的白藜芦醇处理后，HT－29细胞PDCD4蛋白表达水平上调，且具有剂量依赖性，与对照组比较，有统计学意义。白藜芦醇能够显著抑制HT－29细胞株的增殖，诱导凋亡，其作用机制可能与PDCD4蛋白表达上调有关。我们以前的结果显示，白藜芦醇通过miRNA－21调节PDCD4转录后水平，白藜芦醇处理后PDCD4蛋白的表达增加可能与miRNA－21的下调相关［13］。

本试验结果进一步验证了白藜芦醇抗结肠癌的作用及部分的机制，为结肠癌治疗提供了理论依据。

［1］ 陈万青.2004－2005年中国恶性肿瘤发病与死亡的估计［J］.中华肿瘤杂志，2009，31（9）：664－668.

［2］ Fearon ER，Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesis［J］.Cell，1990，61：759－767.

［3］ Kundu JK，Surh YJ.Cancer chemopreventive and therapeutic potential of resveratrol mechanistic perspective［J］.Cancer Lett，2008，269（2）：243－261.

［4］ 高月，李玉凤.白藜芦醇对甲状腺鳞癌细胞株SW579生长及CDC25B蛋白表达的影响［J］.南昌大学学报（医学版），2013，53（5）：4－7.

［5］ 徐凌，王锋，徐选福，等.白藜芦醇通过下调microRNA－151表达抑制肝癌细胞株HepG2细胞活性的研究［J］.上海交通大学学报（医学版），2010，30（7）：774－778.

［6］ 黄笛鸣，单汉国，谢文彪.白藜芦醇对人肝癌细胞转移的影响及其分子机制［J］.安徽医科大学学报，2013，48（9）：1071－1074.

［7］ 阮景明，朱鹏立，蒋娜，等.白藜芦醇对兔动脉粥样硬化及ppARγ相关炎症因子表达的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2013，21（3）：203－208.

［8］ 靳西凤，冉志华.白藜芦醇抗结肠癌作用的研究进展［J］.胃肠病学，2006，11（10）：618－621.

［9］ Delmas D，RébéC，Lacour S，et al.Resveratrol－inducedapoptosis is associated with Fas redistribution in the rafts and the formation of a death－inducing signaling complex in colon cancer cells［J］.JBiol Chem，2003，278（42）：41482－41490.

［10］Gke R，Barth P，Schmidt A，et al.Programmed cell death protein 4 suppresses CDK1／cdc2 via induction of p21（Waf1／Cip1）［J］.Am JPhysiol Cell Physiol，2004，287（6）：C1541－C1546.

［11］Wang Q，Sun ZX，Allgayer H，et al.Downregulation of E－cadherin is an essential event in activating beta－catenin／Tcf－dependent transcription and expression of its target genes in Pdcd4 knockdown cells［J］.Oncogene，2010，29（1）：128－138.

［12］Liang YC，Tsai SH，Chen L，et al.Resveratrol－induced G2 arrest through the inhibition of CDK7 and p34 CDC2 kinases in colon carcinoma HT29 cells［J］.Biochem Pharmacol，2003，65（7）：1053－1060.

［13］Cao Z，Yoon JH，Nam SW，et al.PDCD4 expression inversely correlated with miR－21 levels in gastric cancers［J］.JCancer Res Clin Oncol，2012，138（4）：611－619.

Effects and mechanisms of resveratrol on proliferation in human colonic adenocarcinoma cell line HT－29

ObjectiveTo evaluate the effect and mechanism of resveratrol inhibiting proliferation and inducing apoptosis on human colon cancer cells HT－29.MethodsThe proliferation ofhuman colon cancer line HT－29 wasmeasured by CCK－8 assay.Cell cycle and apoptosisweremeasured using Flow cytometer（FCM）.Western blotting was used to detect PDCD4 protein expression.ResultsDifferent concentrations of resveratrol on cell growth was inhibited in a dose－dependentmanner.The effect on cycle distribution and appotosis were significance difference（P＜0.05）.There was significant difference of the expression of PDCD4 on HT－29 cells before it treated by resveratrol and after that（P＜0.01）.ConclusionResveratrol could inhibite the proliferation，and induce cell cycle arrestand appotosis of HT－29 cell line，whichmay be related to overexpression of PDCD4 on HT－29 cells.

Resveratrol；HT－29；Cell proliferation；PDCD4

R285.5

A

2095－5375（2015）08－0439－003

WANG Jin-ying1，2，QIN Mi-mi1，HAN Ying-ying1，ZHANG Yan1，CAO Zhang1

（1．Department of Pathology，Binzhou Medical University，Binzhou 256603，China；2．Department of Pharmacy，Dongying People′s Hospital，Dongying 257091，China）

山东省自然科学基金（No.ZR2011HQ025、No.ZR2012HL32）；滨州医学院科研启动基金项目（No.BY2010KYQD10）

王金英，女，副主任药师，研究方向：临床药学，E－mail：dywjy9909＠163.com

曹璋，男，博士研究生，副主任医师，研究方向：病理学，Tel：0543－3258654，E－mail：2438747821＠qq.com