郜青叶，王心淼，金子夜

(内蒙古医科大学附属人民医院眼科,呼和浩特 010010)



·论著·

糖尿病性和老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡与Fas、Bax基因的表达

郜青叶，王心淼，金子夜

(内蒙古医科大学附属人民医院眼科,呼和浩特 010010)

[摘要]目的探讨糖尿病性白内障及老年性白内障晶状体上皮细胞(LECs)的凋亡与Fas、Bax基因的关系。方法在白内障超声乳化手术中取糖尿病性及老年性白内障患者的晶状体前囊膜标本45例，应用光镜，电镜观察LECs的凋亡情况，应用RT-PCR定量检测Fas蛋白，Bax蛋白在白内障LECs中的表达。结果两种白内障患者的LECs呈透明样变性，细胞内有空泡(糖尿病性白内障LECS可见增生重叠)，细胞多呈扁平状，大小不均，核固缩，染色质凝聚边缘化。糖尿病性白内障LECs除可见凋亡小体之外，上述改变较老年性白内障更为严重。两种白内障LECs中均有Fas、Bax蛋白表达。Fas蛋白在糖尿病性白内障LECs中的表达平均是老年性白内障的13.34倍，Bax蛋白在糖尿病性白内障LECs中的 表达平均是老年性白内障的38.12倍，差异有统计学意义(P<0.05)。结论两种白内障LECs均出现凋亡，Fas、Bax基因在白内障LECS凋亡中起重要作用。

[关键词]白内障；基因表达;超声乳化白内障吸除术；上皮细胞

随着全球人口老龄化，特别是糖尿病患者发病率不断上升，白内障的发病率也日趋增高。近年来，许多学者认为，晶状体上皮细胞(LECs)凋亡是非先天性白内障发病共同的细胞学基础，但LECs凋亡及其凋亡相关基因在白内障发展过程中的具体生物学机制尚不清楚[1-2]。目前认为Fas、Bax是促进细胞凋亡的重要基因。我们应用RT-PCR定量检测Fas、Bax在两种不同类型的白内障LECs中的表达，进一步探讨Fas、Bax蛋白在白内障细胞凋亡中的作用，为今后在控制细胞凋亡水平、预防白内障方面提供实验依据。

1对象与方法

1.1研究对象收集2012年5月至2014年5月在我院行白内障超乳手术的白内障患者43例(45眼)，其中糖尿病患者22例(23眼)，年龄53~85岁(平均69.98岁)，糖尿病病史5年以上(合并视网膜增殖性病变3例)大于白内障病史。入院前内科已确诊为2型糖尿病，术前空腹血糖控制在8.3 mmol/L以下，尿糖转阴。老年性白内障21例(22眼)，年龄55~82岁(平均年龄68.5岁)，排除其他眼疾引起白内障的因素，白内障术前诊断标准：视力小于0.4(裸眼、矫正)，晶状体混浊(核2~4级)，在“超乳”手术中由同一位术者完成连续环形撕囊取得中央部晶状体前囊膜标本，直径>5 mm。将糖尿病性和老年性白内障患者的晶体前囊膜标本各5例做逆转录PCR(RT-PCR)监测，其余样本做光镜及电镜检测。

1.2方法

1.2.1光镜标本制作取下晶状体前囊膜标本，缓冲液冲洗干净，平铺于载玻片，滤纸吸除水分，干燥5 min，10%中性甲醛固定1 h，苏木素伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.2电镜标本制作快速取材切成1 mm3小块，放入装有3%戊二醛的小瓶内前固定2h；然后经PBS漂洗3次，每次15 min；经1%四氧化锇后固定1 h；经PBS漂洗3次，每次15 min；经50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%梯度脱水，各浓度脱水时间15 min；经浸透剂浸透、包埋剂包埋、聚合、修快、超薄切片、醋酸双氧铀与柠檬酸铅双染色后上镜观察。

1.2.3RT-PCR定量检测把晶状体前囊膜标本放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本呈粉状后加入Trizol总RNA提取试剂保存5 min加氯仿0.2 mL，用力震荡，离心管充分混匀，室温下放置5~10 min，用Trizol法提取总RNA，采用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，然后采用PrimlscripttmRT.reayent.Kit.withgDNA.Eraser进行cDNA反转录，将各样品cDNA十倍稀释后取2 μL做模板分别用于目的基因引物和内参基因引物进行扩充，同时在60~95℃进行溶解曲线分析，取5 μLRNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶自动成像仪保存图像并定量分析，根据Real Time PCR原始检测结果按照2-△△ct相对定量计算公式计算出各样品的目的基因相对定量结果即其他各样品相对于对照样品的基因mRNA转录水平的差异。

1.3统计学处理使用SPSS13.0统计软件处理数据，计量资料采用两样本均数t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1镜下检查结果光镜下观察白内障LECs呈透明样变性，细胞内可见空泡，糖尿病性白内障LECs有增生重叠现象[3]。电镜下两种白内障患者LECs细胞形态大小不一，以扁平状为主，内质网空泡变性，核固缩，胞浆浓缩，核膜皱褶呈不规则形，染色质分布不均匀，凋亡细胞与晶体囊膜结合疏松，有部分脱离。糖尿病性白内障LECs中可见凋亡小体，白内障LECs中未见到凋亡小体，糖尿病性LECs凋亡情况比老年性白内障更为严重。

2.2各基因扩增的标准曲线选取样本cDNA进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2 μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60~95℃进行融解曲线分析，仪器自动绘制出对应的内参基因标准曲线和目的基因的标准曲线。各标准曲线的R2均达到0.99，说明线性相光度很高,且扩增效率均在90%以上，因此可采用此种方法和上述引物进行后续样本的扩增分析。

2.3目的基因相对定量结果根据RealTimePCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异，结果数据见表1。

表1　各样品的目的基因相对表达量

从表1中分析可以看出，糖尿病患者白内障晶状体前囊膜样本中Fas与Bax基因的表达显著高于老年性患者，说明糖尿病患者白内障晶状体前囊膜的细胞衰老程度相比老年性患者更加严重[4]。由于个体差异原因，在同一种疾病的患者群体里，Fas与Bax基因分别表达的量并不一致，但从群体角度分析，糖尿病患者的表达量显著高于老年性患者(P<0.05)。因此，我们可以得出结论，糖尿病患者的白内障受损程度显著高于老年性患者。

3讨论

目前有许多新技术新方法从形态学观察细胞凋亡的变化，本实验电镜下观察到凋亡细胞体积缩小变形大多呈扁平状，与晶体囊膜脱离，与周围细胞间隙增大，线粒体肿大，细胞密度增加，核质浓缩，染色质分布不均，可见凋亡小体。糖尿病性白内障LECs细胞凋亡情况比老年性更为严重[5]。

Fas、Bax蛋白在促进白内障晶体上皮细胞凋亡中起重要作用，目前LECs导致白内障的发生已是人们关注的热点，但从客观上来说，对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还不够全面，比较清楚的通路有细胞凋亡的膜受体通路、细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学通路[6]。Fas是一种跨膜蛋白[7]，与天然配对的Fasl结合，首先Fasl诱导受体三聚体化，然后再细胞膜上形成凋亡诱导复合物，内含带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD，它是死亡信号转录中的一个连接蛋白，由两部分组成，C端(死亡结构域即DD结构域)和N端(DED，死亡效应结构域)，DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，再以DED和Caspases8原域中的DED相互作用，聚合多个Caspases8分子，该分子随由单链酶原转化成有活性的单链蛋白Caspases，它作为酶原被激活后，可直接破坏细胞结构。灭活或者下调与DNA修复相关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白，由于这些蛋白功能被抑制，使细胞的增值与复制受阻并发生凋亡。Bax蛋白是BC1-2家族中参与细胞凋亡的成员，当诱导凋亡时，它从胞液迁移到线粒体和核膜。在RT-PCR检测中，糖尿病性白内障LECs中Fas蛋白相对定量平均是老年性白内障LECs中的13.22倍[8]，Bax蛋白在糖尿病性白内障LECs中的相对定量平均是老年性白内障LECs中的38.3倍[9],差异有统计学意义(P<0.05)，提示Fas蛋白与Bax蛋白介导的细胞凋亡在白内障的形成中起着重要作用，特别是合并增值性视网膜病变的糖尿病性白内障中更为显著[10]，电镜下也证实糖尿病性白内障的凋亡情况比老年性白内障更为严重。

本实验结果提示我们糖尿病性白内障LECs发生凋亡的过程中可能有促进Fas、Bax蛋白介导细胞凋亡的因素[11]，如果这一因素被发现，就可以抑制Fas、Bax蛋白介导细胞凋亡，减少和预防白内障的发生;为今后药物治疗白内障提供一个新思路。

参考文献

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[11] 范伟，吉祥，喻长泰.老年性和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的超微结构改变[J].美中国际眼科杂志，2002,9(2)：24-26.

Diabetic cataracts and senile cataract lens epithelial cell apoptosis and the expression of Fas,Bax gene

GaoQingye，WangXinmiao，JinZiye

(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010010，China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the relationship between lens epithelial cells (LECs) apoptosis of the diabetic cataract and senile cataract and the expression of Fas,Bax.MethodsForty-five cases were selected from diabetic and senile patients' anterior lens capsules specimens,using light and electron microscopic to observe apoptosis of LECs,and applying RT-PCR to quantitatively detect expression of Fas and Bax in cataract LECs.ResultsThe two LECs of cataract patients were hyaline degeneration.Cells had vacuoles.(The diabetes cataract LECS visible proliferation overlap).Cells were mostly flat,uneven size,nuclear pyknosis,marginalization of chromatin condensation.In LECs of diabetic cataract,these changes above of diabetic cataract even more serious than those in senile cataract.Two kinds of cataract in the LECs had both protein expression of Fas and Bax.Fas protein expression in diabetic cataract LECs was 13.34 times as high as senile cataract.Bas protein expression in diabetic cataract LECs was 38.12 times as high as senile cataract.and significant differences was found between them(P<0.05).ConclusionThe typical apoptosis was observed in two kinds of cataract LECs.Fas and Bax genes play an important role in cataract LECs apoptosis.

[Key words]Cataract；Gene expression;Phacoemulsification；Epithelial cells

(收稿日期：2015-01-22)

Corresponding author：Jin Ziye,Email:jinziye1987@126.com

中图分类号：R776.1

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.006

通信作者:金子夜，医师，Email:jinziye1987@126.com

作者简介：郜青叶，主任医师，教授，硕士生导师，Email:13347101200@163.com

基金项目：内蒙古自治区科技厅基金资助(20110501)