孙淼，李岭，李启红，李慧姣，李俊平，杨承槐

(中国兽医药品监察所，北京 100081)



鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存期试验

孙淼，李岭，李启红，李慧姣，李俊平*，杨承槐*

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

对保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验，结果表明：4个不同保存年代的IBV M41株毒种均能使雏鸡100%出现鸡传染性支气管炎典型症状，病毒含量均≥106.0EID50/0.1 mL。其中一支毒种在-70 ℃以下保存22年11个月，其毒力和病毒含量均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版)规定，能够满足检验需求。本试验为探寻IBV M41株毒种更加合理的保存期提供了参考。

鸡传染性支气管炎病毒；M41株；毒力；保存期

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病[1]。该病典型的症状表现为喘气、咳嗽、打喷嚏、气管啰音、流鼻液等。疫苗免疫是当前预防和控制鸡传染性支气管炎的主要措施[2]，疫苗的质量是影响免疫效果最重要的一环，国内外有多种针对不同致病型或血清型的疫苗毒株和疫苗效力评价用强毒株。鸡传染性支气管炎病毒M41株既可作为鸡传染性支气管炎灭活疫苗的生产用毒种，又是检验用强毒株。二〇〇〇年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》[3](简称《兽用生物制品规程》)中规定，IBV M41株在-70 ℃以下，保存期为4年。生产用毒种及检验用强毒的纯净性和毒力是影响疫苗质量的关键性因素，而毒种的繁殖及鉴定不仅耗时费力，还会增加污染机会。因此，制定更为合理的毒种保存期将提高工作效率、有效降低毒种污染外部病原微生物的风险。本实验室利用4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的IBV M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验，以期为制定鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种更加合理的保存期提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒种 IBV M41株，病毒制品检测室分别于1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月繁殖、冻干，检定合格后交由中国兽医微生物菌种保藏管理中心在-70 ℃条件下保存。

1.1.2 SPF鸡和SPF鸡胚 均购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 对雏鸡的毒力 每批冻干的毒种从-70 ℃冰箱中任取1支，按照《兽用生物制品规程》中对雏鸡的毒力测定方法，分别按瓶签注明的装量用灭菌生理盐水作10倍稀释，各滴鼻接种4日龄SPF雏鸡10只，每只0.05 mL，隔离饲养观察10日，每日观察接种雏鸡是否出现鸡传染性支气管炎典型症状。

1.2.2 病毒含量测定 每批冻干的毒种任取2支，分别用灭菌生理盐水作10倍系列稀释至10-7，取10-5、10-6、10-7三个滴度，各经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚接种0.1 mL，置37 ℃条件孵育，每日照蛋。孵育144 h后，取出所有鸡胚，检查鸡胚胎儿病变。根据特异病变数，按Reed-Muench法计算EID50。

2 结果

2.1 对雏鸡的毒力 不同保存年代的IBV M41株毒种对雏鸡的毒力结果如表1所示。

表1 不同保存年代的鸡传染性支气管炎病毒M41株对雏鸡的毒力测定结果

由表1可以看出，在攻毒后第6日，4个保存年代的毒种均使接种雏鸡100%发病，对雏鸡的毒力仍符合《兽用生物制品规程》规定(至少应有80%雏鸡出现鸡传染性支气管炎典型症状)。

2.2 病毒含量测定 不同保存年代的鸡传染性支气管炎病毒M41株病毒含量测定结果如表2所示。可以看出，1991年4月(-70 ℃保存22年11个月)冻干保存的毒种病毒含量未下降；1996年6月(-70 ℃保存17年9个月)、2001年1月(-70 ℃保存13年2个月)和2006年12月(-70 ℃保存7年3个月)冻干保存的毒种病毒含量分别下降0.77、0.05和0.1个滴度，仍符合《兽用生物制品规程》规定。

表2 不同保存年代的鸡传染性支气管炎病毒M41株病毒含量测定结果

3 讨论与小结

在禽用活疫苗生产过程中，生产用毒种的质量直接决定疫苗免疫效果的好坏。而检验用强毒株作为成品效力检验中的攻毒毒株，也对疫苗质量的把控有重要意义。我国对不同兽用活疫苗的生产用毒种和检验用强毒均制定了相应的标准，并要求生产企业严格遵照执行，需要对毒种进行诸如病毒含量、安全性、免疫原性、纯净性、特异性和毒力等检验合格后方可进行生产销售。毒种的繁殖、制备、鉴定工作不仅会消耗一定的人力、物力和财力，还需要较长的时间，而且过程中还具有生物安全的潜在风险。因此，制定更为科学合理的毒种保存期很有必要。

吴涛等对-70 ℃条件下保存6年、12年、16年的新城疫病毒HB1株和-70 ℃条件下保存8年、14年、19年的新城疫病毒F株进行了保存期试验，各毒种的病毒含量均未发生明显变化，建议适当延长HB1株和F株的保存期[4]。鸡传染性支气管炎病毒在低温保存时稳定，鸡胚尿囊液和细胞培养物中的病毒，可在-30～-60 ℃存活几个月，而冻干真空密封的病毒在低温下存活可达24年[1]。有报道称，冻干的感染性尿囊液经真空密封后置于冰箱中，至少可存放30年[2]。影响冻干种毒质量的因素有很多，比如真空度、冻干保护剂、剩余水分等。

本研究中的IBV冻干种毒的真空度和剩余水分等指标均符合相关标准，选用蔗糖-牛奶作为冻干保护剂有利于毒种的长期保存。《兽用生物制品规程》规定，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种在-70 ℃以下，保存期为4年。本研究中，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存22年11个月其对雏鸡的毒力未减弱，均10/10发病，病毒含量均未明显下降，仍符合《兽用生物制品规程》规定。该毒种在-70 ℃以下的保存期至少为22年11个月，建议在修订规程时可适当增加保存期。

[1] 殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第二版. 北京：科学出版社, 1997: 675-681.

[2] Saif Y M. 禽病学[M]. 第十二版. 北京：中国农业出版社，2012: 129-151.

[3] 农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程(二〇〇〇年版)[M]. 北京: 科学出版社, 2000: 212-214.

[4] 吴涛，毛娅卿，王嘉，等. 鸡新城疫活疫苗种毒HB1株和F株保存期试验[J]. 中国兽药杂志, 2011, 45(6): 13-15.

(编 辑：李文平)

Preservation Period Test of Master Seed Virus of Infectious Bronchitis Virus Strain M41

SUN Miao, LI Ling, LI Qi-hong, LI Hui-jiao, LI Jun-ping*, YANG Cheng-huai*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

The virulence on chicks and virus titers of four batches of master seed virus of infectious bronchitis virus strain M41, stored at temperature of -70 ℃ in China Veterinary Culture Collection Center in different ages (1991.4, 1996.6, 2001.1, 2006.12) were tested. The results indicated that all of the chicks inoculated with four batches of virus showed the typical symptoms of avian infectious bronchitis. The virus titers were all above 106.0EID50/0.1mL. The virulence and virus titers of master seed virus of infectious bronchitis virus strain M41, stored at temperature of -70 ℃ for 22 years and 11 months, complied with the veterinary biological products regulation of the People’s Republic of China. The viruses meet the requirements of test. This laid the foundation of finding a more scientific preservation period of IBV strain M41.

infectious bronchitis virus; strain M41; virulence; preservation period

孙淼，从事动物生物制品检验及相关研究。

李俊平，E-mail: lijunping03@163.com；杨承槐，E-mail:ychenghuai@163.com

2015-04-16

A

1002-1280 (2015) 08-0007-03

S858.31