陈蔷，宋志超，张崇威，朱雷

(河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)



动物源食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留检测超高效液相色谱-串联质谱法研究

陈蔷，宋志超，张崇威，朱雷

(河南省兽药饲料监察所，郑州 450008)

建立了动物源食品中酰胺醇类药物(氯霉素CAP、甲砜霉素TAP、氟苯尼考FF)及其代谢物(氟苯尼考胺FFA)残留检测的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法。样品经氨化乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，氨化乙酸乙酯反萃取，电喷雾正/负离子多反应监测(MRM)模式检测。四种药物在0.2～50μg/L的系列浓度范围呈线性相关，样品中CAP的检测限为0.1μg/kg，定量限为0.2μg/kg；TAP、FF、FFA检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。在0.2～5μg/kg的添加浓度范围内平均回收均为80%～120%，变异系数均小于15%。结果表明该方法简单快速、灵敏度高、重复性好，适用于动物源食品中酰胺醇类及其代谢物残留检测。

动物源食品；酰胺醇类药物；代谢物；残留；超高效液相色谱-串联质谱

酰胺醇类属于广谱抗生素，包括氯霉素(CAP)及其衍生物，常见的药物包括氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF)。CAP在动物具有较高的治疗指数[1]，但其对骨髓造血机能有抑制作用，可引起血小板减少、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、溶血等，美国食品及药物管理局于1984年将其列为法定禁用兽药，许多国家严格禁止将CAP用于食品动物(特别是蛋鸡和奶牛)，我国农业部在2002年也将CAP列入《食品动物禁用兽药及其化合物清单》。TAP为CAP的衍生物，毒性较CAP低，具有较强的免疫抑制作用。FF是一种TAP的衍生物，分子中不含与抑制骨髓造血机能有关的-NO2基团，大大降低了对动物和人体的毒性且抗菌活性优于CAP和TAP，FF虽不会引起骨髓抑制和再生障碍性贫血，但具有胚胎毒性。由于在兽医临床和养殖过程的滥用、误用抗生素，细菌耐药性问题越来越严重，因此各国制订了酰胺醇类的最大残留限量。

酰胺醇类的残留检测方法有ELISA法[2]、EIA法[3]、HPLC法[4]、GC法[5]、GC-MS法[6]和LC-MS/MS法[7]等，其中确证方法主要是质谱法。GC法和GC-MS法均需要进行衍生化，前处理较为繁琐，定量亦不够准确，而LC-MS/MS法具有快速、简便、定性定量准确、灵敏度高的特点，已成为目前多残留检测确证普遍使用的方法。酰胺醇类的LC-MS/MS检测标准多为单一药物或多种药物原型的检测方法，但FF在动物源食品中的主要代谢产物为氟苯尼考胺(FFA)，故检测酰胺醇类及其代谢物FFA更具有实际意义。本研究建立了猪、鸡、牛、羊(肌肉、肝脏、肾脏)、鸡蛋、牛奶中CAP、TAP、FF和FFA残留检测的UPLC-MS/MS方法，为动物源食品中酰胺醇类及其代谢物残留监测提供了简单快速、灵敏度高的检测技术。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 Acquity UPLC-Xevo TQ-S质谱联用仪，配电喷雾离子源(ESI),美国Waters公司；XP205电子分析天平,感量0.01 mg,梅特勒-托利多仪器公司；ALC-2100.2电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；IKA MS3 Basic涡旋混合器,广州仪科实验室技术有限公司；TARGIN TECH VX-03多管涡旋振荡器,北京踏锦科技有限公司；3K-30离心机,Sigma公司；TTL-DC II氮吹仪,北京同泰联科技发展有限公司；100 μL、200 μL、1000 μL、5000 μL移液器,德国Eppendorf公司。

1.2 试剂 CAP、TAP、FF标准品,中国兽医药品监察所;FFA标准品,TRC公司；氯霉素-D5(CAP-D5)标准品,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲砜霉素-D3(TAP-D3)、氟苯尼考-D3(FF-D3)、氟苯尼考胺-D3(FFA-D3)标准品,TRC公司；乙腈、甲醇为色谱纯，Sigma公司；氨水、乙酸乙酯、无水硫酸钠、氯化钠、甲酸铵、正己烷为分析纯；试验用水为Milli-Q高纯水。

1.3 标准和内标溶液的配制 准确称取CAP、TAP、FF、FFA标准品适量，用甲醇溶解并稀释成约100 μg/mL的标准贮备液；分别称取CAP-D5、TAP-D3、FF-D3、FFA-D3标准品适量，用甲醇溶解并稀释成约100 μg/mL的内标贮备液。分别准确吸取CAP、TAP、FF、FFA标准贮备液适量，用甲醇稀释至含CAP为1 μg/mL，其余为5 μg/mL的混合标准中间液。混合内标中间液同法配制，并用20%甲醇溶液稀释成含CAP-D5为10 μg/L、TAP-D3、FF-D3、FFA-D3为50 μg/L的混合内标工作液。

1.4 样品前处理 称取2±0.02 g试样(猪、鸡、牛、羊的肌肉、肝脏和肾脏组织、鸡蛋、牛奶)于50 mL离心管中，添加混合内标工作液100 μL，加乙酸乙酯-氨水(98∶2)10 mL，涡旋混匀(牛奶样品另加无水硫酸钠3 g，混匀)，涡旋振荡10 min，8000 r/min离心5 min，取上清液于另一50 mL离心管中；残渣用乙酸乙酯-氨水(98∶2)10 mL重复提取一次，合并乙酸乙酯层。提取液于50℃水浴吹干，在残留物中加入4%氯化钠溶液3 mL，涡旋使溶解，再加入4%氯化钠溶液饱和的正己烷5 mL，涡旋混合30 s，8000 r/min离心5 min，弃去正己烷，重复脱脂一次。在下层水相中加入乙酸乙酯-氨水(98∶2)5 mL，涡旋振荡5 min，8000 r/min离心5 min，吸取上层有机相于10 mL离心管中，用乙酸乙酯-氨水(98∶2)5 mL重复萃取一次，合并有机相，50 ℃水浴吹干，残渣加入20%甲醇溶液1.0 mL，涡旋使复溶，过0.22 μm滤膜供UPLC-MS/MS仪测定。

1.5 仪器分析条件 色谱柱为Acquity UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) ，流动相A为乙腈，B为5 mmol/L的甲酸铵溶液，梯度洗脱条件见表1，流速0.3 mL/min，柱温35℃，进样量5 μL。

表1 梯度洗脱条件

电离电压为3.0 kV(负离子模式)和1.5kV(正离子模式)，源温150℃；脱溶剂气温度500℃；锥孔气流速150 L/Hr；脱溶剂气流速1000 L/Hr；多反应监测(MRM)模式采集。各药物的定性、定量离子对、离子源、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 药物的定性、定量离子对、离子源、锥孔电压和碰撞能量

2 结果

2.1 标准曲线 精密量取酰胺醇类混合标准中间液和混合内标工作液适量，加20%甲醇溶液配制成含CAP 0.2、0.4、1、2、4、10 μg/L和含TAP、FF、FFA 1、2、5、10、20、50 μg/L的标准曲线，其中CAP-D5浓度为1 μg/L，其余三种内标浓度为5 μg/L。在本方法确定的条件下，以测试药物和其对应的内标的特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，各药物线性关系良好，相关系数r均大于0.999，见表3。

表3 药物标准曲线及相关系数

2.2 检测限和定量限 采用在空白组织中添加目标化合物的方法，依据特征离子色谱峰信噪比S/N≥3为方法检测限，S/N≥10为方法定量限，测得CAP的检测限为0.1 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg；TAP、FF、FFA的检测限为0.5 μg/kg，定量限为1 μg/kg。对照溶液、空白鸡肝及空白鸡肝添加各药物后得到的特征离子质量色谱图见图1-图3。

图1 酰胺醇类对照溶液特征离子质量色谱图

图2 空白鸡肝特征离子质量色谱图

2.3 精密度与准确度 在空白鸡肝中分别添加LOQ、2.5LOQ、5LOQ三个浓度的药物进行回收率试验，每一个浓度做5个平行，按内标法以峰面积比计算，其平均回收率、变异系数见表4。同时考察鸡肌肉、肾脏组织和猪、牛、羊肌肉、肝脏、肾脏组织以及鸡蛋、牛奶，显示各药物的平均回收率均为80%～120%，变异系数均小于15%(表5-表17)，满足残留分析的要求。

3 讨论与小结

3.1 质谱条件优化 在ESI-模式下对CAP、TAP、FF及其内标进行母离子扫描，确定其质子化分子离子[M-H]-，在ESI+模式下对FFA及其内标进行离子扫描，确定其质子化分子离子[M-H]+，以这些分子离子作为母离子对其子离子进行扫描，确定其子离子并优化锥孔电压、碰撞能量等参数。

3.2 液相条件优化 由于FFA极性相对其他三种酰胺醇类药物较强，在反相色谱系统中保留时间较短，加之又采用ESI+模式，背景噪音及基质效应较强，需着重优化FFA的保留时间，以减小基质效应。酰胺醇类残留检测的LC-MS/MS方法常用的流动相体系为乙腈-水[7]，采用ESI+模式采集时，通常在流动相中加入甲酸使分析物易于离子化，但ESI-模式会受到抑制。试验尝试用5 mmol/L甲酸铵溶液代替水，结果发现，在同样的洗脱梯度条件下，乙腈-甲酸铵体系相对于乙腈-水体系CAP、TAP、FF及其内标物保留时间无差异，但FFA和FFA-D3保留时间增加且响应值大幅增加，故选择乙腈-甲酸铵为流动相体系。

图3 空白鸡肝添加0.2 μg/kg CAP和1 μg/kg TAP、FF、FFA特征离子质量色谱图

药物添加浓度范围/(μg·kg-1)平均回收率/%变异系数/%CAP0.2,0.5,192.0,93.5,93.06.2,4.6,5.4TAP1,2.5,5103.8,104.6,101.74.9,1.7,4.6FF1,2.5,592.3,85.6,83.94.5,1.4,2.4FFA1,2.5,5101.0,105.4,96.18.4,6.3,3.1

表5 空白鸡肉中药物添加回收率结果(n=5)

表6 空白鸡肾中药物添加回收率结果(n=5)

表7 空白猪肉中药物添加回收率结果(n=5)

表8 空白猪肝中药物添加回收率结果(n=5)

表9 空白猪肾中药物添加回收率结果(n=5)

表10 空白牛肉中药物添加回收率结果(n=5)

表11 空白牛肝中药物添加回收率结果(n=5)

表12 空白牛肾中药物添加回收率结果(n=5)

表13 空白羊肉中药物添加回收率结果(n=5)

表14 空白羊肝中药物添加回收率结果(n=5)

表15 空白羊肾中药物添加回收率结果(n=5)

表16 空白鸡蛋中药物添加回收率结果(n=5)

表17 空白牛奶中药物添加回收率结果(n=5)

3.3 前处理条件的优化 国内外关于酰胺醇类提取液的报道常见的有乙酸乙酯[4，6，8]、乙腈[9]、丙酮[10]、乙酸乙酯-乙腈-氨水[11]以及乙酸乙酯-氨水[5，7，11]等，由于CAP、TAP和FF呈弱酸性，FFA呈弱碱性，提取溶剂在不同pH条件下对性质不同的药物提取效率有差别，当提取液呈碱性时，弱碱性的FFA呈分子态，利于FFA的萃取，从而提高回收率。在参考其他方法的基础上，分别采用乙酸乙酯-乙腈-氨水(49∶49∶2)、乙酸乙酯-氨水(98∶2)两种溶剂作为动物源食品中的酰胺醇类的提取液。结果表明：乙酸乙酯-乙腈-氨水提取液浓缩较慢，浓缩后残渣较多，样品基质效应大，在空白基质中添加酰胺醇类后FFA不出峰。而乙酸乙酯-氨水作为提取液毒性相对较小、干扰杂质少、容易蒸干、回收率稳定。因而，本方法选择了乙酸乙酯-氨水(98∶2)作为提取剂。

由于采用乙酸乙酯-氨水作为提取溶剂，有大量脂质及类脂物质同时被提取出来，必须进行净化。正己烷作为常见的脱脂溶剂可以除去绝大部分脂肪及类脂物质，然而正己烷与乙酸乙酯互溶，不能直接在提取液中加入正己烷脱脂，必须将提取液转化为与正己烷极性不同的溶剂体系，所以需要将提取液浓缩至干，然后用水溶液复溶。有报道将氨化乙酸乙酯提取液浓缩后用0.5%甲酸水溶液[7](或20%甲醇溶液或水)复溶，再用正己烷脱脂，在实际操作中发现，脱脂过程中极易产生乳化现象，而乳化部分药物不能回收，降低了药物的回收率和重复性。本试验脱脂时在复溶液加入中性强电解质(氯化钠)，利用其盐析效应促进有机溶剂萃取、降低乳化并促使有机相与水相分层，从而达到脱脂和防乳化目的。脱脂后再用乙酸乙酯-氨水(98∶2)反萃取，4%氯化钠溶液同样提供一个盐析环境，使酰胺醇类被有效地萃取出来。样品经提取-脱脂-反萃取-再浓缩后，复溶液较澄清，可直接过滤上机。

试验建立了猪、鸡、牛、羊(肌肉、肝脏、肾脏)、鸡蛋、牛奶等动物源食品中CAP、TAP、FF和FFA残留检测的UPLC-MS/MS方法，该方法简单快速、灵敏度高、精密度好，可以满足酰胺醇类及其代谢物残留检测的需要。

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(编 辑：陈希)

Determination of Amphenicols and Metabolite Residues in Animal Derived Food by UPLC-MS/MS

CHEN Qiang，SONG Zhi-chao，ZHANG Chong-wei，ZHU Lei

(HenanProvinceInstituteofVeterinaryDrugandfeedControl，Zhengzhou450008,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the determination of amphenicols(CAP, TAP, FF) and metabolite(FFA) residues in animal derived food.The samples were extracted by ammoniated ethyl acetate.The fat was removed by hexane. The solution after defatting were extracted by ammoniated ethyl acetate again.The 4 drugs were detected by electrospray ionization in the positive /negative ion multiple reaction mode. The calibration curves of the 4 drugs were linear over the concentration ranges of 0.2～50 μg/L.The limit of detection of CAP was 0.1 μg/kg,and the limit of quantification was 0.2 μg/kg. The limits of detection of TAP,FF and FFA were 0.5 μg/kg,and the limits of quantification were 1 μg/kg. The control samples were spiked in 0.2～5 μg/kg，and the average recoveries ranged from 70% to 120%. The coefficient of variation was less than 15%. This method can be applied for the determination of amphenicols and metabolite residues in animal derived food.

animal derived food;amphenicols;metabolite;residue;UPLC-MS/MS

陈蔷，硕士，兽医师，从事兽药残留检测和研究，E-mail：cqchongchong@163.com

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S859.84