李倩，张玉洁，李丹，王鹤佳，仲锋，徐秉恩

(中国兽医药品监察所，北京 100081)



高效液相色谱法检测多种动物组织中噁喹酸和氟甲喹残留量的研究

李倩，张玉洁，李丹，王鹤佳，仲锋*，徐秉恩

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

建立了猪、牛、羊的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏四种组织中噁喹酸、氟甲喹残留量检测的高效液相色谱法。试样经磷酸盐缓冲溶液提取，C18固相萃取柱浓缩净化，用高效液相色谱分析，荧光检测器检测，外标法定量。动物组织中噁喹酸和氟甲喹的检测限为10 μg/kg，定量限为20 μg/kg。噁喹酸、氟甲喹在3～500 ng/mL范围内呈良好的线性关系。在20～300 μg/kg的浓度添加水平上，其平均回收率为63%～100%，批内、批间的相对标准偏差均小于15%。

噁喹酸；氟甲喹；残留；动物组织；高效液相色谱法

噁喹酸和氟甲喹属于第二代喹诺酮类抗菌药物，作用机理主要是抑制DNA旋转酶A亚单位，破坏它的活性，使脱氧核糖核酸、核糖核酸及蛋白质的合成受干扰，细胞不能再进行分裂，从而起到杀菌作用[1]。本类药物一般毒性较低，安全范围大[2]，但是，随着噁喹酸和氟甲喹在兽医临床上的广泛应用，违规使用可导致动物性产品中药物残留超标，对食用者造成危害[3]。农业部第235 号公告[4]对噁喹酸和氟甲喹在多种动物组织中的最高残留限量( MRL) 进行了规定。现在所用标准农业部第236号公告[5]《动物性食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法(鸡)—高效液相色谱法》在检测动物品种及动物组织覆盖面上均不能满足实际检测的要求。因此，为使检测方法更加简便、易于操作，同时增加检测的动物品种及组织，更好地满足实际检测工作的需求，本研究在上述检测方法的基础上做了进一步改进，建立了噁喹酸、氟甲喹在猪、牛、羊的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏四种组织中的残留检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备 Agilent1100 高效液相色谱仪(配荧光检测器和二元梯度洗脱系统)；C18色谱柱: 250 mm×4.6 mm (i.d)，粒径5 μm；SPE柱:Bond Elut C18固相萃取柱(200 mg/3 mL)；微孔滤膜：0.45 μm；分析天平：感量0.00001 g；天平：感量0.01 g；组织匀浆机；涡旋混合仪；振荡器；高速离心机。

1.2 试剂和溶液噁喹酸标准品 (含量≥98.0%，DrEhrenstorfer GmbH，批号：C15788000)；氟甲喹标准品(含量≥99.0%，浙江仙居捷大医药，批号：2011323)；氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯；甲醇、四氢呋喃、乙腈均为色谱纯；水为去离子水。1mg /mL噁喹酸和氟甲喹标准储备液，噁喹酸和氟甲喹标准工作液，5.0 mol/L氢氧化钠溶液，0.03 mol/L氢氧化钠溶液，磷酸盐缓冲溶液，0.02 mol/L磷酸溶液。

1.3 色谱条件 流动相：0.02 mol/L磷酸溶液-乙腈-四氢呋喃(68∶16∶16)；检测波长：激发波长325 nm，发射波长369 nm。柱温30℃。流速0.8 mL/min。进样量20 μL。

1.4 标准曲线的绘制精密量 取适量噁喹酸和氟甲喹标准工作液，用流动相稀释成浓度为3，10，50，100，300，500 ng/mL的系列溶液。

1.5 样品的提取和净化提取 称取(2±0.05)g试料，置50 mL离心管中，加磷酸盐缓冲溶液10.0 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min。15000 r/min离心10 min，取上清液于另一50 mL离心管中。残渣中再加磷酸盐缓冲溶液10.0 mL；重复提取一遍。合并两次上清液，涡旋混匀。15000 r/min离心10 min，取上清液备用。净化：固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL预洗。取备用液6.0 mL过柱，水2 mL淋洗，挤干。用流动相2.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱法测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的测定准确量 取适量标准工作液，用流动相稀释成3～500 ng/mL的对照溶液，供高效液相色谱分析。以各色谱峰峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线(图1)。标准曲线方程分别为噁喹酸y=0.0504x-0.0943，相关系数r=0.9992；氟甲喹y=0.0602x-0.1549，相关系数r=0.9991。

2.2 方法精密度和准确度 采用标准添加法，在空白组织中添适量标准溶液，制成含噁喹酸和氟甲喹浓度为20～300 μg/kg的添加样品进行回收率测定，每个浓度设定5个平行样品，同时进行空白试验，重复3次，求每个样品的回收率和批内、批间相对标准偏差(RSD)。噁喹酸和氟甲喹标准、空白猪肝脏及添加色谱图如图2所示。本实验中所用空白组织均为实验室无添加饲养并经检测的不含有待测组分的空白样品。结果表明，噁喹酸和氟甲喹在20、100、300 μg/kg添加水平的平均回收率在63%～100%之间。批内相对标准偏差<12%，批间相对标准偏差<15%，结果表明，重复性好，回收率高，方法的准确度和精密度可以满足残留检测的要求(表1)。

2.3 方法灵敏度空白试料 按1.5项下提取净化方法处理后进行色谱分析，在相应的保留时间处，空白试料对所测分析物无干扰。在猪、牛、羊三种动物的各肌肉、脂肪、肝脏、肾脏四种组织中添加标准溶液，使其在组织中的添加浓度分别为5、10、20 μg/kg。按照1.5项下提取净化方法处理后，经HPLC检测。测定结果显示，添加浓度为10 μg/kg时，药物的信噪比(S/N)约等于3，添加浓度为20 μg/kg时，信噪比均>10，因此，确定噁喹酸、氟甲喹在猪、牛、羊三种动物的各肌肉、脂肪、肝脏、肾脏四种组织中的检测限为10 μg/kg，定量限为20 μg/kg。

图1 噁喹酸、氟甲喹标准曲线图

图2 噁喹酸和氟甲喹标准、空白猪肝及添加色谱图

3 讨论与小结

3.1 提取条件的优化 农业部第236号公告《动物性食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法(鸡)—高效液相色谱法》中用两种不同的提取液对鸡组织进行提取，分别是pH 7.0的磷酸盐缓冲液用于鸡肌肉、脂肪；pH 4.0～5.0磷酸盐溶液用于鸡肝脏、肾脏。经过对两种提取液的考察，本方法仅采用pH 7.0磷酸盐缓冲液为提取液，即可满足对不同动物组织的提取，使方法的操作更为简单快捷。236号公告方法采用4000 r/min离心取上清液，由于离心速度慢，上清液比较浑浊，容易造成后续过固相萃取柱时柱子堵塞。本方法提高离心转速至15000 r/min，上清液清透，过柱容易。

3.2 净化条件的优化 236号公告方法采用取10.0 mL提取液过100 mg/ mLC18固相萃取柱进行净化，2.0 mL流动相洗脱，由于固相萃取柱体积小，过柱溶液量大，往往容易造成柱子堵塞，使实验无法进行。经过反复实验，本方法采用取6.0 mL提取液过200 mg/3mL C18固相萃取柱进行净化，2.0 mL流动相洗脱。不仅柱容量更加，过柱的提取液也减少，柱子不会堵塞，而且缩短了实验的时间。

3.3 稳定性考察 本研究同时还首次对噁喹酸和氟甲喹的标准储备液、标准工作液、标准对照液进行稳定性考察，结果表明，置2～8℃冰箱中保存，在3个月的时间内，稳定性良好。

本研究采用高效液相色谱荧光检测器检测，建立了噁喹酸、氟甲喹在猪、牛、羊的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏四种组织中的残留检测方法。该方法操作简单，灵敏度高，准确度和精密度好，动物组织覆盖范围广，可以很好地满足实际检测工作的需要。

[1] 李剑勇，鲁润华.动物用氟喹诺酮类药物的研究进展概况[J]．中兽医医药杂志，2004，6：19-23.

[2] 李倩，张玉洁，王鹤佳，等.噁喹酸、氟甲喹在鸡蛋和牛奶中残留量的检测方法研究[J].中国兽药杂志，2012，46(8): 20-23.

[3] 吴超程，林丽，张素霞，等.高效液相色谱法测定鸡饲料中噁喹酸喹酸的含量[J].中国饲料，2013，4：36-38.

[4] 中华人民共和国农业部．公告第235 号—动物性食品中兽药最高残留限量[S]．

[5] 中华人民共和国农业部．公告第236 号—动物性食品中噁喹酸和氟甲喹残留检测方法(鸡)—高效液相色谱法[S]．

(编 辑：侯向辉)

Determination of Oxolinic Acid and Flumequine in Tissues of Several Animals by HPLC

LI Qian，ZHANG Yu-jie LI Dan，WANG He-jia，ZHONG Feng*，XU Bing-en

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl，Beijing100081，China)

An HPLC method for the determination of oxolinic acid and flumequine in muscle，fat，liver and kidney of swine，cattle and sheep has been developed.The sample residues were extracted by phosphate solution，purifid with C18 solid phase extraction column，seperated by HPLC with a fluorescence detector and quanlified by external standard calibration curves.The limit of detection was 10 μg/kg foroxolinic acid and flumequine，with quantification limit of 20 μg/kg.A good linearity of the calibration curves for oxolinic acid and flumequine was obtained within the range of 3～500 ng/mL.The average recoveries at level of 20～300 μg/kg were 63%～100%.The intra-and-interbatch variation coefficients were both less than 15%.

oxolinic acid；flumequine；residues；animal tissue；HPLC

李倩，硕士，从事兽药科研管理及残留检测工作。

仲锋。E-mail：zhongfeng@ivdc.org.cn

2015-04-30

A

1002-1280 (2015) 08-0035-04

S859.84