朱 勇，罗宗涛，周丽绒，吴银良，江潇潇

(1.农业部农产品质量安全风险评估实验室 (宁波)，浙江宁波 315040;2.宁波市农产品质量检测中心，浙江宁波 315040)

豆芽是深受广大消费者欢迎的食品，具有较高的营养价值。但因近年新闻媒体曝光市场豆芽存在的质量安全隐患，如添加各类生长调节剂等，使豆芽质量安全问题受到社会各界的广泛关注。较为常见的添加剂为氯吡苯脲，是具有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂，其生物活性却较6-苄氨基嘌呤高10～100倍，能影响植物芽的发育，加速细胞有丝分裂，促进细胞增大和分化，防止果实和花的脱落的作用，从而促进植物生长、早熟、延缓作物后期叶片的衰老、增加产量，广泛用于农业，园艺和果树［1-3］。中国登记的使用氯吡脲的农作物有6种，分别为黄瓜、西瓜、甜瓜、葡萄、猕猴桃和枇杷［4］。在日常的豆芽监测中，时有个别样品检出氯吡脲这一事实也证明个别豆芽生产商拓展用途，将氯吡脲用于豆芽生产。

生产过程中氯吡脲使用浓度与豆芽体内残留量之间的关系、残留风险及快速检测准确定性的方法研究都至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料

WatersUPLC-XEVO超高效液相色谱串联质谱仪，Acquity BHE C18色谱柱 (美国Waters公司);DYJ-S6031豆芽机 (广东小熊电器有限公司);氯吡脲 (四川施特优化工有限公司);氯吡脲标准品(CAS号:68157-60-8，SIGMA公司);无水甲醇、甲酸均为色谱纯试剂 (德国merck公司)。

供试绿豆为购自超市的上海裕田农业科技有限公司生产的禾煜牌绿豆，黄豆为购自种子公司的当年新豆。豆芽均在农业部农产品质量安全风险评估实验室 (宁波)实验室内采用小熊豆芽机 (DYJS6031)孵化。

1.2 UPLC条件

色谱条件。Acquity BHE C18色谱柱 (100 mm×2.1 mm，内径1.7μm);流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件:流动相B在0.5 min内保持20%，然后在2.5 min内上升到80%，保持1.5 min;再在0.1 min内降至20%，保持 1.4 min;流速 0.3 mL·min-1，进样量10μL，柱温30℃。

质谱条件。ESI源正负离子模式电离，多反应监测 (MRM)，毛细管电压2.0 kV，萃取锥孔电压30 V，RF透镜电压0.5 V，离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃，锥孔气流速50 L·h-1，脱溶剂气流速1 000 L·h-1，倍增器电压650 V，二级碰撞气为氩气，定性离子对m/z:248.2＞129.0*，248.2＞155.0(248.2为母离子，129.0为定量离子，129.0与155.0同为定性离子，*代表定量离子);锥孔电压:24 V;碰撞能量:16，14 eV。

1.3 样品制备

1.3.1 豆芽制作

绿豆芽、黄豆芽制作。分别称取绿豆、黄豆各80 g，加水250 mL，浸泡3 h后，将豆均匀撒于豆芽机的培育盘上，豆芽机选择“绿豆/黄豆，正常”选项开机孵化，前5 h为泡豆阶段，隔5 min喷水1次，5 h之后是培育时间，隔1 h喷水1次，喷水时间均为1 min，孵化水温为26.4℃。上机后16，40 h，从培育盘中随机选择5颗豆芽，测量其芽长，然后将培育盘放入浓度梯度依次为0，0.02， 0.04， 0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.8 和1.0 mg·L-1的氯吡脲溶液中浸泡，浸泡时间1 min，再次上机孵化，64 h后等豆芽成熟后再次随机选择5颗豆芽，测量其芽长，然后采收称重。

1.3.2 氯吡脲提取

豆芽样品打浆后，称取5 g样品，加入10 mL甲醇，匀浆，以5 000 r·min-1离心3 min后吸取上清液200μL，与800μL甲酸溶液混合均匀，过0.22μm滤膜后进行LC-MS/MS分析。

1.4 标准曲线的测定

准确配制1.0，2.0，5.0，10.0和20.0μg·L-1的标准浓度工作液，进行液相色谱串联质谱仪分析。

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，制作标准曲线。

2 结果与分析

2.1 方法的检出限、回收率和精密度

在绿豆芽和黄豆芽空白样品中添加标准溶液，添加3个浓度分别是0.01，0.10，1.00 mg·kg-1，每浓度添加3个样品。按上述条件1.3.2进行样品处理，按1.2进行样品分析，测定加标回收率，考察方法的准确性和可靠性。结果表明，3个添加浓度的回收率分别为89.1%，81.9%和81.7%，均在70%～120%，批内变异系数分别为4.2%，4.0%和 3.9%，均小于 10%，检测限均为0.001 mg·kg-1，可满足风险评估样品监测的要求。

2.2 豆芽中氯吡脲的分析结果

2.2.1 氯吡脲对绿豆芽的生长影响

从表1可知，与未使用氯吡脲的对照比较，孵化绿豆芽使用浸泡氯吡脲溶液浓度在0.02～1.00 mg·L-1，在生长初期16 h，由于绿豆芽还未浸泡氯吡脲，所以胚轴长度上相差不大，直径也相差不大，此时胚根还未长出来;第1次浸泡后24 h(上机40 h，)再次测量，与对照相比胚根胚轴没有更长反而有缩短的迹象;第2次浸泡后24 h(上机64 h)后，绿豆芽成熟，使用了氯吡脲的豆芽比对照组胚根和胚轴更短，豆芽更粗，随着浸泡浓度的增加，胚根胚轴都有缩短的迹象，抑制效果明显。将采收后的绿豆芽称重，采用0.02 mg·L-1氯吡脲浸泡的绿豆产量最大，随着浸泡浓度的增加，绿豆芽的产量均有一定程度的下降。这与朱杰丽等［5］在研究氯吡脲对杨梅果实生长时发现过高浓度反而对杨梅产生偏生、偏小、偏少的情况相吻合。

表1 氯吡脲对绿豆芽孵化的影响

2.2.2 氯吡脲对黄豆芽的生长影响

从绿豆芽的孵化结果来看，浸泡的氯吡脲浓度超过0.10 mg·L-1后，生长趋势反而抑制，短小很多。

在黄豆芽试验中，将氯吡脲的最高浓度设在0.10 mg·L-1。黄豆芽孵化使用的氯吡脲溶液浓度为0.02～0.10 mg·L-1，黄豆芽试验的结果与绿豆芽相类似 (表2)。

表2 黄豆芽孵化时使用氯吡脲的试验结果

在生长初期16 h，由于黄豆芽此时均未浸泡氯吡脲，所以胚轴长度上相差不大，直径也相差不大，此时胚根还未长出来;在第1次浸泡后24 h(上机40 h，)再次测量，与对照相组比较其胚轴、胚根有缩短的迹象，但无规律;在第2次浸泡后24 h(上机64 h)黄豆芽成熟，浸泡了氯吡脲的黄豆芽比对照组胚轴变短，特别是浸泡浓度为0.10 mg·L-1时，缩短25%，胚根变化不大;但浸泡过氯吡脲后黄豆芽胚轴直径均比对照组粗。低浓度的氯吡脲溶液能促进黄豆芽胚轴的伸长，但随着氯吡脲浓度的增加，抑制效果明显，反应在采收后的重量上，采用0.02 mg·L-1浓度浸泡后的黄豆产量最大，随着浸泡浓度的增加，黄豆芽的产量均有一定程度的下降。

2.2.3 氯吡脲在豆芽的残留风险

氯吡脲是一种植物生长调节剂，据国内外现有的毒理评估资料，对哺乳动物毒性低。氯吡脲对鼠的急性经口LD50为4 902 mg·kg-1bw，属于低毒;兔急性经皮LD50≥ 2 000 mg·kg-1bw，也属于低毒，鼠急性吸入LC50≥3.0 mg·L-1，属于无毒;兔眼睛刺激性为中等强度，但对皮肤无刺激性;鸟类急性经口LD50≥2 250 mg·kg-1，亚急性LC50≥5 620 mg·kg-1，均为低毒;对冷水鱼和温水鱼，LC50＞9.2和8.8 mg·kg-1，属于中等毒性。慢性和亚慢性试验结果表明，氯吡脲只对鼠肾脏有轻微的影响，而对其他器官无影响，也无神经毒性、致癌或内分泌干扰毒性。欧盟、美国、澳大利亚和日本评估后规定氯吡脲每日允许摄入量 (ADI)值分别为 0.05，0.07，0.07 和 0.093 mg·kg-1bw［6-9］。

按照国际上普遍认可的分析评估原理和方法，用式 (1)估计每日摄入量 (EDI)，慢性摄入风险用式 (2)，估计每日摄入量占ADI的百分率表示:

当风险商＞100时，表示存在不可接受的较大风险，数值越大，风险越大;当风险商≤100时，表示风险可以接受，数值越小，风险越小。

以本次豆芽机孵化黄绿豆芽为例，豆芽体内所含氯吡脲浓度随着浸泡液浓度的增加而上升，浸泡溶液为1.0 mg·L-1时，绿豆芽最高残留量为0.035 mg·kg-1，以绿豆芽黄豆芽产量最大的0.02 mg·L-1浸泡浓度，绿豆芽体内含0.002 mg·kg-1，黄豆芽含0.003 mg·kg-1，约为氯吡脲浓度的10%～15%，残留量不高。

根据表3，不同年龄阶段消费人群的体重以及蔬菜消费量，同时根据中国农业大学的调查估算数据，我国成年人豆芽平均每日消费量15 g左右，儿童按成人的1/2计，按实验室豆芽机的黄豆芽0.003 mg·kg-1残留量为Ci，同时以最为严格的欧盟ADI值为考量，以食用实验室豆芽机孵化豆芽的作为情形1，氯吡脲的风险商在各年龄段在0.0013%～0.0035%;如果假设所有年龄段人群每天消费的所有蔬菜均为实验室豆芽机孵化的豆芽作为情形2，氯吡脲的各类人群摄入量也只有 0.014～0.030μg·kg-1，仅占 ADI值的0.027% ～0.059%，此数据与张志恒等［10］报道的氯吡脲在果蔬中的慢性膳食摄入风险相吻合。所以即使按照最大风险原则每天消费的蔬菜均为含

式中:EDI为估计每日摄入量 (μg·kg-1bw);Ci为第i种食物的平均残留值 (mg·kg-1);Fi为第 i种食物的消费量 (g·d-1);bw为体重 (kg)。0.003 mg·kg-1残留量进行评估，各类人群的氯吡脲摄入量也远低于每日允许摄入量，通过实验室豆芽机孵化出的豆芽风险可以接受 (表3)。居民实际食用豆芽的量与上述的调查数据会有出入，但考虑到上述的评估已显示氯吡脲的膳食风险很低，因此对最终结论基本没有影响。

表3 不同年龄阶段消费人群的体重、蔬菜消费量及氯吡脲风险

3 小结与讨论

豆芽生长中单独使用氯吡脲的效果不明显，0.02 mg·L-1的氯吡脲浸泡对产量的增加有作用，随着浸泡液浓度的增加，抑制效果开始产生，作为一种具有细胞分裂素活性的苯脲类植物生长调节剂，其生物活性较6-苄氨基嘌呤高10～100倍，所以使用的浓度很低，从实验效果看增产作用不明显，故与其他植物生长调节剂混合使用的概率较大。以浓度为0.02 mg·L-1浸泡液为例，豆芽中残留量仅为0.003 mg·kg-1，即使按照最大风险原则进行评估，各类人群的氯吡脲摄入量也远低于每日允许摄入量，风险可以接受。

［1］ 朱杰丽，杨柳，柴振林，等.氯吡脲对“徐香”猕猴桃果实品质的影响［J］.福建林业科技，2014(1):113-115，165.

［2］ 张立恒，高秀岩，潘凤荣，等.赤霉素与氯吡脲对“早霞玫瑰”葡萄无核化及果实品质的影响 ［J］.北方园艺，2014(14):25-27.

［3］ 宋新，丁璞，李先宽，等.氯吡脲对五味子果实形态和木脂素的影响 ［J］.中国中药杂志，2015，39(9):1579-1583.

［4］ 中华人民共和国农业部农药检定所.农药电子查询服务系统 ［DB/OL］.http://www.ny100.cn/.2011-09-14.

［5］ 朱杰丽，杨柳，柴振林，等.不同浓度氯吡脲对东魁杨梅果实生长及品质影响 ［J］.江苏农业科学，2013，41(12):172-174.

［6］ European Commission Health ＆ Consumer Protection Directorate-General.Review report for the active substance forchlorfenuron［R/OL］. (2005-09-23) http://ec.europa.eu/food/plant/protection/evaluation/newactive/forchlorfenuron_draft_review_report.pdf.2011-09-14.

［7］ United States Environmental Protection Agency.Pesticide fact sheet:forchlorfenuron［R/OL］.(2004-09).http://www.epa. gov/opprd001/factsheets/forchlorfenuron. pdf. 2011-09-14.

［8］ Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority.Publicrelease summary on evaluation of the new active forchlorfenuron ［R/OL］.(2005-09).http://www.apvma.gov.au/registration/assessment/docs/prs_forchlor-fenuron.pdf.2011-09-14.

［9］ 协和醗酵工业株式会社バイオケミカル事业本部.ホルクロルフェニュロンの毒性试験の概要［R/OL］.(1998-02-02)http://wwwsoc.nii.ac.jp/pssj2/journal/tec_info/forchlor.pdf.2011-09-14.

［10］ 张志恒，汤涛，徐浩，等.果蔬中氯吡脲残留的膳食摄入风险评估［J］.中国农业科学，2012，45(10):1982-1991.