吉爱军，　陆建伟，　李苏平，　井昶雯

论著

树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞增殖及CyclinD1、p16表达的影响

吉爱军，陆建伟，李苏平，井昶雯

作者单位： 210009江苏南京，江苏省肿瘤医院镇痛科(吉爱军)；江苏省肿瘤医院肿瘤内科(陆建伟)；

江苏省肿瘤医院科研科(李苏平，井昶雯)

第一作者： 吉爱军，男，医学博士，副研究员，研究方向：肿瘤姑息及癌痛诊疗研究，E-mail:jajoffice@163.com

【摘要】目的探讨树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞增殖及CyclinD1、p16表达的影响，进一步研究其抗胃癌的可能机制。方法培养人胃癌SGC-7901细胞，MTT法观察不同时间(24 h,72 h)不同浓度树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。用流式细胞法检测树舌多糖对细胞周期阻滞及其凋亡的影响。实时荧光定量法检测树舌多糖作用人胃癌SGC-7901细胞72 h后CyclinD1及p16的表达情况。结果随着树舌多糖浓度增高和作用时间的延长,对人胃癌SGC-7901 细胞增殖抑制率逐渐增高(P<0.05)，同一浓度不同时间的细胞增殖抑制率相比有显著性差异(P<0.05)。人胃癌SGC-7901细胞在 G0/G1期表现出明显的增加，S期细胞明显的减少，各浓度组均明显诱导细胞凋亡，其凋亡率随树舌多糖浓度增加而提高。实时荧光定量法检测显示，随着树舌多糖浓度的增加，CyclinD1表达逐渐减少，p16表达逐渐增加。树舌多糖浓度0.5mg/ml,1.0 mg/ml时,CyclinD1及p16表达存在显著性差异(P<0.05)。结论树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞有抑制增殖和促凋亡作用，呈时间和浓度依赖性，且G0/G1期细胞数量增多,S期细胞数量减少。RT-PCR法检测显示，CyclinD1呈现低表达，p16呈现高表达，由此推测，CyclinD1表达下调与p16表达上调可分别发挥细胞周期的正、负反馈调节，共同作用产生细胞增殖抑制及促进凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。

【关键词】树舌多糖；胃癌；SGC-7901；增殖；CyclinD1；p16

树舌(Ganoderma applanatum)又称“老牛肝”、“扁芝”或“扁木灵芝”，是一种大型担子菌，灵芝科植物树舌灵芝的干燥子实体。树舌药用见于《中国药用真菌图谱》和《长白山植物药志》，具有清热、止痛、化积、止血、化痰、抗癌等功效。树舌的化学成分包括多糖、甾体化合物、三萜、脂类、氨基酸、多肽、蛋白质类、生物碱类、酚类等。树舌具有广泛的药理活性，主要包括调节机体免疫系统、抗肿瘤、抗病毒、消炎抗菌、降血糖、调节血压、阻碍血小板凝集和强心作用[1]。据研究报道，树舌多糖作为树舌的重要成分，具有一定的抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用，且无毒性。国内学者从增加宿主免疫功能到对肿瘤细胞的直接作用、对癌基因、抑癌基因的调控以及对蛋白质组表达的影响等方面对树舌多糖抗肿瘤作用进行了实验研究[2-5]。本实验通过树舌多糖作用于体外培养的胃癌细胞SGC-7901，观察其对胃癌细胞增殖和cyclinD1及p16的影响，进一步探讨其可能的抗胃癌机制。

1材料与方法

1.1树舌多糖的制备树舌多糖(含量30%)购于哈尔滨乐泰药业有限公司岔林河中药提取厂。按要求醇沉和去蛋白得到实验用树舌粗多糖。PBS溶解配成浓度为40 mg/ml原液，微孔滤膜滤过除菌，4℃冰箱保存，用时将完全培养基稀释到所需浓度。

1.2人胃癌SGC-7901细胞培养将人胃癌SGC-7901细胞置于细胞培养瓶中，选择DMEM培养基(含有10%胎牛血清)，在37℃，饱和湿度5%的CO2培养箱中培养，每2~3天更换培养液，待细胞长满瓶底80%时，弃培养液，PBS冲洗，再加入0.25%胰蛋白酶消化2~3 min，倒掉胰酶，加入培养液，吹打均匀成单细胞悬液，传代培养。

1.3MTT法检测人胃癌SGC-7901细胞增殖MTT(美国51gma公司)；二甲基亚矾(DMSO)购自GIBCO公司。用胰蛋白酶消化细胞一定的时间，待细胞呈圆形后立即加含血清的1640培养基终止；置于离心机，50×10 g/min 3min，弃去上清后重新加新培养基悬浮，计数；将细胞悬浮稀释至密度30%~40%。铺于96孔板中，每孔200 μl，96孔板四周不加细胞悬浮液，加入适量培养基，以防边缘效应，还应设置空白对照和细胞对照；置于37℃，0.5%CO2培养箱中孵育24 h；第二天进行加药抑制。共设置了4个浓度，每个浓度6个平行孔，树舌多糖浓度分别为0.125 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml；加药后，置于37℃，0.5%CO2培养箱中孵育48 h、72 h；最后测MTT。计算抑制率：

抑制率(IR%)=(1-处理组平均A值/对照组平均A值)×100%

1.4流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡先收集各实验组贴壁细胞的上清，然后PBS洗2次，加胰酶消化(注意：弃液和PBS洗液均收集)；加培养基终止消化，打匀，再分别收到各自离心管中；离心，1 000 rpm，5 min弃液；用PBS洗涤细胞1次(离心2 000 rpm，5 min)，收集并调整细胞浓度为1×106/ml；加100μl RNase A 37℃水浴30 min；再加入400μl PI染色混匀，4℃避光30 min；上机检测细胞周期，记录激发波长488 nm处红色荧光。

1.5实时荧光定量法检测CyclinD1mRNA及P16mRNA表达样本共分细胞对照组、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml组等4组。总RNA的提取方法按试剂盒(上海捷瑞生物科技有限公司)说明进行，并取RNA样品用灭菌水稀释样品100倍或适当的倍数，测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量，按以下计算RNA的浓度=OD260×稀释倍数×0.04 μg/μl，OD260/280 在1.8~2.1视为抽提的RNA的纯度很高。取2 μg总用RNA逆转录，扩增条件：65℃水浴5 min后立即置于冰上，加入试剂的混合液，震荡混匀后离心，37℃水浴60 min，95℃水浴5 min,-20℃保存备用。用ABI SYBR Green荧光定量试剂盒对mRNA表达水平进行检测。PCR引物序列如下：

cyclin D1( F primer5′GCCCTCGGTGTCCTACTTCAAAT3′，R primer 5′ CTCCTCCTCGCACTTCTGTTCCT3′)；p16 (F primer 5′TGAGAAACCTCGGGAAACTTAGAT3′，R primer 5′CGGTAGTGGGGGAAGGCATATA3′); GAPDH (F primer 5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′,R primer 5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′)。总反应体系:2 × SYBR Green PCR Master Mix 10 μl， 10 μmol /L 上、下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，去离子水补足至20 μl。循环参数:50 ℃ 2 min; 95 ℃预变性2 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 个循环。

1.6统计方法通过SPSS13.0软件统计分析实验数据，计量资料采用χ2检验，计数资料采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响随着树舌多糖浓度(0,0.125 mg/ml,0.25 mg/ml,0.5 mg/ml,1.0 mg/ml)增加和作用时间(48 h,72 h)的延长,人胃癌SGC-7901 细胞抑制率逐渐增高，作用48 h后，细胞抑制率分别为0.87%、3.78%、21.75%、70.84%，与对照组比差异有统计学意义(P<0.05)；作用72 h后，细胞抑制率分别为10.41%、21.71%、47.59%、87.92%，与对照组比差异亦有统计学意义(P<0.05)。同一浓度不同时间的细胞抑制率相比，差异均有统计学意义 (P<0.05)。树舌多糖对人胃癌SGC-7901 细胞的增殖抑制作用呈现时间、剂量依赖关系。

表1　不同浓度树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用

注：组间比较，*：P<0.05；**：P<0.01。组内比较,Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。

2.2树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响用流式细胞术检测细胞周期与凋亡情况,用不同浓度的树舌多糖(0,0.25 mg/ml,0.5 mg/ml,1.0 mg/ml)处理人胃癌SGC-7901细胞72 h后，0.25 mg/ml,0.5 mg/ml,1.0 mg/ml树舌多糖水提浓度组细胞在 G0/G1期表现出明显的增加(P<0.05)，由53.36% 升至 60.56%,S期细胞表现出明显的减少，其分布由29.22%减至15.44%，提示树舌多糖可将人胃癌SGC-7901细胞阻滞在G0/G1期(表2)。细胞凋亡分析结果：各浓度组均明显诱导细胞凋亡(P<0.05)，其凋亡率分别为：3.53%，10.87%，15.85%，29.78%，见图1。

表2　不同浓度树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞周期的影响(72 h)

注：与对照组比较，各组P值均<0.05。

图2　不同浓度树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响(72 h)

2.3Real-time PCR法检测人胃癌SGC-7901细胞cyclinD1及p16的表达情况检测经不同浓度树舌多糖(0，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml)处理后的人胃癌SGC-7901细胞 (72 h) cyclinD1mRNA及p16mRNA的表达情况。随着树舌多糖浓度的增加，cyclinD1mRNA表达逐渐减少，p16mRNA表达逐渐增加，呈现浓度依赖性，树舌多糖浓度0.5 mg/ml，1.0 mg/ml时，cyclinD1mRNA及p16mRNA表达与Actin mRNA比值(2-ΔΔct)与对照组相比均存在显著性差异(P<0.05)，见表3。

表2　不同浓度树舌多糖处理后(72 h)的人胃癌SGC-7901细胞

注：*及**分别代表与对照组相比P<0.05、P<0.01；Δ及ΔΔ分别代表各浓度组组内与低浓度组相比P<0.05、P<0.01。

3讨论

肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机制被破坏的疾病[6]。细胞周期中存在G1/S和G2/M期两个重要调控点[7]。细胞周期调控作用主要是通过细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependentkinase，CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)相互调控实现的[8]。

本实验通过分析不同浓度的树舌多糖作用于人胃癌SGC-7901细胞，结果显示，树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞的增殖有明显的抑制作用，而且其抑制作用有时间、剂量依赖性，即树舌多糖的抑制作用随着时间的延长，药物剂量的增加而增强。同时，树舌多糖可诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡，流式细胞仪测定有明显的凋亡峰出现，树舌多糖以时间、剂量依赖方式影响人胃癌SGC-7901细胞的凋亡，树舌多糖可使人胃癌SGC-7901细胞G0/G1期数量增多，推测树舌多糖可能主要通过作用于人胃癌SGC-7901细胞的G0/G1期，可使部分细胞停滞于该期，从而抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖。RT-PCR法检测结果显示树舌多糖浓度为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml时，CyclinD1mRNA及p16mRNA表达与Actin mRNA比值与对照组相比差异均存在统计学意义(P<0.05)，且具有浓度依赖性，CyclinD1呈现低表达, p16呈现高表达，之间呈负相关关系(P<0.05)。Cyclin D是细胞周期调控中的重要蛋白，主要用于G1/S期控制点，为目前公认的癌基因。Motokura等[9]发现，Cyclin D在正常细胞调控和癌变过程中均发挥重要作用，其过表达可激活CDK4或CDK6活性，缩短G1期，一定程度上降低细胞增殖对有丝分裂原的依赖，造成细胞周期调节失控和细胞异常增殖。p16是G1/S期检验点一个重要的相关基因，其编码的p16蛋白为Cyclin D-CDK4激酶的抑制因子，是一个重要的细胞周期调节物。p16是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)，在G1/S期发挥重要的负向调控作用，p16与CyclinD1竞争结合CDK4并抑制其活性，从而抵制对RB蛋白的磷酸化，阻止细胞进入S期，使细胞周期停滞。p16表达上调可启动细胞周期的负反馈系统, P16蛋白与CDK4特异性结合从而使CDK4失活,反向调节细胞周期活动, 从而阻止细胞无限制从G1期进入S期，抑制细胞增殖失控，起到抗肿瘤作用。树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞的细胞周期的影响，通过本实验研究可推测，是通过影响CyclinD1及p16等重要基因表达，从而发挥其对细胞周期的正负反馈调控作用，抑制胃癌细胞增殖，促进其凋亡，发挥其抗胃癌作用。

参考文献：

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[3]李荣辉,潘洪明,邹宇,等.树舌多糖抑制胃癌MGC-803细胞增殖及对酪氨酸激酶活性的影响[J].中国老年医学杂志,2010,11(21)：3101-3103.

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[6]EvanGI, Voused KH. Proliferation cell cycle and apoptosis in cancer [J].Nature,2001，411(6835):342-348.

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[9]Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl12 linked candidate oncogene[J].Nature,1991,350(6318):512-515.

Effect of ganoderma applanatum polysaccharides on human gastric carcinoma Cell SGC-7901,anti-proliferation and exprssion of CyclinD1,p16JIAijun1,LUJianwei2,LISuping3,JINChangwen3(1.DepartmentofAnalgesia,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China;2.DepartmentofOncology,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China;3.DepartmentofScientificResearch,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China)

Correspondingauthor:JIAijun,E-mail:jajoffice@163.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Ganoderma applanatum polysaccharides(GAPS) on proliferation and apoptosis of the human gastric carcinoma cell line 7901 and its possible mechanism of action on CyclinD1,p16. MethodsThe growth inhibition effect of GAPS on human gastric carcinoma cell line 7901 was observed by using MTT assay, and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression of cyclinD1mRNA and p16mRNA in SGC-7901 cells were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. ResultsThe SGC-7901 cells were treated with various concentrations of GAPS for 48 h and 72 h, cell viability was determined by Alamar Blue assay. Cell growth was suppressed by GAPS of different Concentrations(0,0.125 mg/ml,0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml,1.0 mg/ml), GAPS inhibited the growth of gastric cancer cells in a dose-dependent manner. The cells were treated with various concentrations (0,0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml,1.0 mg/ml) of GAPS for 72 h. The results showed that GAPS were capable of inducing an increase in the percentages of G1-phase cells and the number of apoptotic cells (P<0.05). Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of CyclinD1 and p16 at 72 h after GAPS treatment. The results revealed a significant down-regulation of mRNA expression of CyclinD1, and up-regulation of the mRNA expression levels of p16 as compared with the controls.ConclusionsThe results show that GAPS has significant action of anti-proliferation and pro-apoptosis on human gastric carcinoma cell line 7901.The down-regulation of CyclinD1 suppresses the cell proliferation inhibition and promotes the cell apoptosis. p16 showed high expression, which can activate the negative feedback of cell cycle. The results suggest that GAPS may have an effect on the pathway of gastric cancer genesis,it prevents the cells from G1/G0 phase to S phase.

Keywords：Ganoderma applanatum polysaccharides；Gastric cancer；SGC-7901；Proliferation；CyclinD1；p16

[收稿日期：2015-06-23][本文编辑：李筱蕾]

文章编号：1674-4136(2015)06-0356-04

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.06.004

通讯作者:吉爱军,E-mail:jajoffice@163.com

基金项目：江苏省中医药局科技项目(项目编号：LZ13231)