综述

CRISPR基因编辑技术在肿瘤研究中的应用

李君红，张富婷，桑春艳，王晓辉，惠玲

[作者单位]730050 兰州，兰州军区兰州总医院医学实验中心 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室

[关键词]基因,肿瘤；基因,修饰；核糖核酸酶类；综述

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.09.020

自2013年研究人员第一次展示成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat， CRISPR)基因编辑技术在真核细胞基因编辑方面的巨大潜力之后，近几年在生物研究的各领域产生了革命性影响。在肿瘤研究方面，从基础研究到临床研究，再到转化医学的应用，CRISPR基因编辑技术均显示出强大的生命力和广泛的应用前景。为此，本文对CRISPR基因编辑技术在肿瘤研究方面的应用进行综述，以期为肿瘤研究者提供资料。

1常规基因编辑技术在肿瘤研究中的应用及缺陷

肿瘤发生过程通常是由基因或表观遗传学层面造成原癌基因的激活或抑癌基因的失活(或二者皆有)所造成。原癌基因可由基因突变或表观遗传学的去甲基化而得到激活；而抑癌基因的失活则是由基因突变或表观遗传学甲基化而失去活性。在目前研究肿瘤发生相关基因的作用时，研究人员通常需要使用cDNA过表达和RNA干扰的方法从正反两方面研究特定基因的潜在致癌或抑癌作用。

虽然这些方法在肿瘤研究过程中取得了丰硕成果，但也必须意识到这些传统方法的一些缺陷：①在RNA干扰方面，由于RNA片段本身的不稳定性，研究人员通常无法精确确定RNA干扰对目的基因的抑制程度。②RNA干扰技术由于RNA片段本身长度的限制和简并性，很容易造成严重的脱靶效应。这些负面效果可能在短期反应中并不明显，但如需验证特定基因在导致肿瘤发生的长期效应中所起的作用则会出现较大影响。③在cDNA过表达方面，常会在细胞或动物模型中造成超出正常生理范围的基因过表达，这会导致细胞信号传导通路的异常，因此不能正确反映特定基因的正常作用，从而对该基因致癌或抑癌功效的解读产生误导。根据目前肿瘤全基因组测序的结果来看，大部分基因突变在肿瘤发生发展过程中并不起直接作用，只有少部分基因突变对肿瘤发生发展起决定作用。利用现有常规基因编辑技术对肿瘤细胞进行研究，很可能对其相关基因突变造成误判。④在体内实验方面，研究人员通常需要通过同源重组对小鼠胚胎干细胞进行基因编辑，建立产生相应的具有特异突变位点的原癌基因或抑癌基因的转基因小鼠模型来进行研究[1-3]。这种技术还可结合Cre和Flp位点特异性重组酶来生成可控激活的等位基因[4]。虽然此技术建立转基因小鼠模型已经相当成熟，但我们必须看到依然存在靶向目标基因效率低、胚胎干细胞操作复杂以及小鼠饲养繁殖耗时费力等缺点。在转基因小鼠模型中激活某特定基因通常是通过同源重组插入相关基因，而特异性失活某基因则通过非同源末端连接。研究人员近来通过使用位点特异的内切酶如锌指核酸酶[5-7]和转录激活子样效应因子核酸酶[8-10]来进行更为精确的基因组编辑，取得了很好的效果，但这种技术同样存在花费巨大且编辑手段复杂繁琐等缺点。

因此，亟需开发新的基因编辑技术，使研究人员能够正常、长期、稳定、高效地调控特定基因的表达。

2CRISPR基因编辑技术的产生及应用

CRISPR基因编辑技术的实现可追溯到1987年，日本科学家Ishino等[11]首次在大肠杆菌IAP基因下游发现了奇怪的29 bp重复序列，与大多数序列重复元件不一样的是，这种序列被32 bp的非重复序列所隔开。13年后，Mojica等[12]终于发现这种奇怪的序列在已知40%以上的细菌和90%的古生菌中广泛存在。2002年，Jansen[13]和Mojica将这种序列正式命名为CRISPR。但其生物学意义尚未明确。在系统分析CRISPR序列的间隔非重复序列信息后，研究者发现CRISPR序列来源于染色体外，起源于噬菌体[14-16]。这个发现揭示了CRISPR序列在细菌中潜在的功能价值。最为重要的是，同年Mojica等[14]发现病毒无法感染含有与其基因序列相同的CRISPR间隔序列的古生菌。这些研究表明CRISPR序列可能具有免疫记忆及防御的作用。CRISPR中的间隔序列可以通过碱基配对来发挥抵抗细菌噬菌体的作用。2007年，Barrangou等[17]第一次通过实验验证CRISPR间隔序列可以通过与细菌噬菌体相应序列的配对来发挥适应性免疫反应。随后，Brouns等[18]发现在大肠杆菌中CRISPR序列可被转录为包含CRISPR间隔序列的小CRISPR RNA(crRNA)来引导Cas核酸酶活性。同年，Marraffini等[19]发现在表皮葡萄球菌中CRISPR体系可阻止质粒的结合，说明Cas核酸酶的作用目标是DNA而非RNA。在随后的几年中，关于CRISPR系统的更多信息被逐渐揭示。2008年，Deveau等[20]发现PAMs在CRISPR序列的识别中起着重要作用。至此，CRISPR系统各元件在细菌免疫系统中的基本作用及运行方式得到基本阐明，但其生物学研究才刚刚开始。2010年，研究人员开始利用CRISPR系统进行一些生物技术方面的研究，如使用CRISPR系统建立具有噬菌体抗性的培养基[21]，以及利用CRISPR系统来进行菌种的系统进化分析等[22-23]。2011年，Sapranauskas等[24]第一次展示CRISPR系统可以在不同菌株中移植并发挥作用。2012年，两项研究发现纯化的Cas9可以在体外实验中通过crRNA的引导切割目标DNA[25-26]。2013年，利用CRISPR系统对哺乳动物基因组进行定向切割，至此通过同源重组或非同源末端连接修复进行的基因编辑技术终于得到实现[27-28]。目前，CRISPR基因编辑技术迅速发展，并在很多模式动物体系中得到应用。

3CRISPR/Cas9基因编辑技术原理

CRISPR/Cas9是一种RNA介导的DNA内切酶，通过一个与目标序列互补的单引导RNA(single guide RNA， sgRNA)引导定位到基因组的目标序列上，此目标序列必须与一个以NGG或NAG形式的PAM序列相邻。CRISPR/Cas9在与目标序列结合后，在特定基因组区域产生双链断裂。DNA双链断裂可被两种DNA修复机制修复：同源重组或非同源末端连接修复。同源重组修复可通过提供外源性DNA模板插入特异序列，包括产生点突变、加入报告基因、插入标记或进行基因修正等。而非同源末端连接修复则可以通过产生插入或缺失突变，从而引起移码突变或产生提前终止密码等。通过CRISPR/Cas9介导在目标基因片段上产生DNA双链断裂，再通过同源重组或非同源末端连接修复机制引入突变或新的基因，就可达到特异性基因编辑的目的。CRISPR/Cas9基因编辑技术原理见图1。

图1　CRISPR/Cas9基因编辑技术原理

4CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠肿瘤模型构建上的应用

在体外基因修饰方面，有文献报道通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对淋巴瘤细胞Trp53基因进行编辑修饰后转入同源小鼠，成功证明了Trp53基因在肿瘤细胞化疗抗性中所起的作用[29]。有学者通过慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术对小鼠造血干细胞及其祖细胞上的多个基因位点进行基因编辑，得到了大量的小鼠急性骨髓白血病细胞模型[30]。利用同样的技术手段，相关文献报道对小鼠造血干细胞及其祖细胞进行实验，证明Mll3是急性骨髓白血病单剂量不足的一个抑癌基因[31]。

根据目前基因组全序列提供的信息，在人类和小鼠基因组上存在大量可供CRISPRR/Cas9基因编辑技术进行染色体重组改造的位点。目前，Blasco等[32]应用携带cas9和sgRNA基因的载体的慢病毒感染小鼠，成功实现了体染色体重组小鼠模型的构建。Maddalo等[33]利用携带cas9和两个sgRNAs基因的载体的腺病毒气管内灌注小鼠导入Cas9和sgRNA基因，从而诱导产生了EML4-ALK倒置的原癌性染色体重组小鼠模型。除了使用病毒作为递送体系进行CRISPR/Cas9基因编辑外，应用脂质体或纳米材料作为CRISPR/Cas9基因编辑递送系统的相关研究也得以实现[34-35]。CRISPR/Cas9基因编辑方法见图2。

图2　CRISPR/Cas9基因编辑方法

另外，有学者还构建出了组成型表达Cre诱导的Cas酶活性小鼠模型[35]，这种小鼠可使研究者仅需要通过载体将sgRNA转入Cas酶活性小鼠模型中就可完成基因编辑的目的。这种模型的成功构建将极大简化基于CRISPRR/Cas9基因编辑技术的小鼠模型构建，对利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立新的小鼠肿瘤模型大有帮助。

5CRISPR/Cas9基因编辑技术介导的多基因修饰

CRISPR/Cas9基因编辑技术的一大优势是能够同时向胚胎干细胞导入多个基因进行修饰。有学者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术一次性干涉小鼠胚胎干细胞8个等位基因；还利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠胚胎8细胞阶段同时干涉两个基因，一步法得到双敲除小鼠模型[36]。在后续研究中，有学者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了触发性的以Cre-loxP为基础的等位基因及报告基因[37]。这些研究均证实了CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建多重失活/激活突变小鼠模型或胚胎干细胞中的优越性。这对快速构建肿瘤相关基因工程小鼠模型将会有巨大的推动作用。Shendure实验室利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，基于同源重组修复机制，实现了在特定基因组区域的系统化多重基因修饰，这为肿瘤致癌热点区域的分析提供了有力手段[38]。除可方便快捷地建立新的动物模型外，CRISPR/Cas9基因编辑技术还可用于对已经建立的动物肿瘤模型进行再编程，引入更多的组成性或触发性原癌基因或抑癌基因，为系统了解原癌基因或抑癌基因相关信号通路在肿瘤发生发展中所起的作用提供更为简单快捷的手段。

由于CRISPRR/Cas9基因编辑技术可在一个动物模型中同时进行多个基因编辑，这将为系统化、网络化研究肿瘤发生发展的分子机制提供有力条件。因肿瘤相关的基因突变通常受多因素调控，而且患者本身的遗传信息也存在异质性。利用CRISPRR/Cas9基因编辑技术在动物模型中可以更大程度模拟临床病例的遗传信息异质性，这对全面了解临床病例肿瘤发生发展的原因，并相应开发适宜的化疗及放射治疗手段具有重要意义。

6CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究上的其他应用

由于CRISPR/Cas9基因编辑技术具有特异性通过sgRNA定位到基因组特异序列的特点，研究人员通过基因改造，将其HNH和RuvC样催化域进行突变，得到了不具有内切酶活性的失去DNA切割活性的Cas9蛋白(dead cas9， dCas9)。dCas9保留了其RNA介导的DNA结合的能力，将其与特异的效应子结合可选择性激活或抑制目的基因[39-44]，达到基因调控的目的。相对于传统的基因调控方法，这种手段是在原位激活或抑制基因表达，克服了病理性高表达、抑制效率不稳定、脱靶效应高等传统方法存在的诸多缺点，对肿瘤细胞信号传导机制的研究大有裨益。除此之外，研究人员还利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外构建了新的嵌合抗原受体修饰T细胞[45]，这种细胞可被精确定位到特异位点上[46]。肿瘤细胞发生发展的一个重要条件就是逃避机体免疫识别，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术改造机体免疫细胞，从而达到重新特异性识别肿瘤细胞的目的，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术逃避机体免疫识别将可能成为肿瘤免疫疗法的新方向。

7结语

CRISPRR/Cas9基因编辑技术具有灵活多变、操作简单、应用广泛等诸多优点，目前已经成为基因编辑领域的新宠。利用CRISPRR/Cas9基因编辑技术可对胚胎干细胞进行多次、同时多位点的基因编辑，并能在短时间内高效率筛选出大量成功编辑的胚胎干细胞样本；还可对已经建立的转基因小鼠模型进行重编辑，得到新的嵌合转基因小鼠模型。另外，利用其多重基因编辑的特性，针对临床个体基因异质性产生相应的多重转基因细胞或动物模型来达到个性化治疗及药物筛选的目的，也将对转化医学提供新的契机。CRISPRR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究中的应用，将极大加快肿瘤发生发展相关信号传导通路的研究进展，同时也为肿瘤治疗策略提供了新的思路。

[参考文献]

[1]Smithies O, Gregg R G, Boggs S S,etal. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination[J].Nature, 1985,317(6034):230-234.

[2]Thomas K R,Folger K R, Capecchi M R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome[J].Cell, 1986,44(3):419-428.

[3]Mansour S L, Thomas K R, Capecchi M R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes[J].Nature, 1988,336(6197):348-352.

[4]Frese K K, Tuveson D A. Maximizing mouse cancer models[J].Nat Rev Cancer, 2007,7(9):645-658.

[5]Bibikova M, Golic M, Golic K G,etal. Targeted chromosomal cleavage andmutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases[J].Genetics, 2002,161(3):1169-1175.

[6]Bibikova M, Beumer K, Trautman J K,etal. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases[J].Science, 2003,300(5620):764.

[7]Urnov F D, Miller J C, Lee Y L,etal. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases[J].Nature, 2005,435(7042):646-651.

[8]Christian M, Cermak T, Doyle E L,etal. Targeting DNA double-str, breaks with TAL effector nucleases[J].Genetics, 2010,186(2):757-761.

[9]Li T, Huang S, Jiang W Z,etal. TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors, FokI DNA-cleavage domain[J].Nucleic Acids Res, 2011,39(1):359-372.

[10]Hockemeyer D, Wang H, Kiani S,etal. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases[J].Nat Biotechnol, 2011,29(8):731-734.

[11]Ishino Y, Shinagawa H, Makino K,etal. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J].J Bacteriol, 1987,169(12):5429-5433.

[12]Mojica F J, Diez-Villasenor C, Soria E,etal. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J].Mol Microbiol, 2000,36(1):244-246.

[13]Jansen R, van Embden J D, Gaastra W,etal. Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes[J].OMICS, 2002,6(1):23-33.

[14]Mojica F J, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J,etal. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J].J Mol Evol, 2005,60(2):174-182.

[15]Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies[J].Microbiology, 2005,151(Pt 3):653-663.

[16]Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A,etal. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J].Microbiology, 2005,151(Pt 8):2551-2561.

[17]Barrangou R, Fremaux C, Deveau H,etal. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science, 2007,315(5819):1709-1712.

[18]Brouns S J, Jore M M, Lundgren M,etal. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J].Science, 2008,321(5891):960-964.

[19]Marraffini L A, Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J].Science, 2008,322(5909):1843-1845.

[20]Deveau H, Barrangou R, Garneau J E,etal. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus[J].J Bacteriol, 2008,190(4):1390-1400.

[21]Mills S, Griffin C, Coffey A,etal. CRISPR analysis of bacteriophage-insensitive mutants (BIMs) of industrial Streptococcus thermophilus-implications for starter design[J].J Appl Microbiol, 2010,108(3):945-955.

[22]Horvath P, Romero D A, Coute-Monvoisin A C,etal. Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus[J].J Bacteriol, 2008,190(4):1401-1412.

[23]Horvath P, Coute-Monvoisin A C, Romero D A,etal. Comparative analysis of CRISPR loci in lactic acid bacteria genomes[J].Int J Food Microbiol, 2009,131(1):62-70.

[24]Sapranauskas R, Gasiunas G, Fremaux C,etal. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J].Nucleic Acids Res, 2011,39(21):9275-9282.

[25]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I,etal. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science, 2012,337(6096):816-821.

[26]Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P,etal. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2012,109(39):E2579-E2586.

[27]Cong L, Ran F A, Cox D,etal. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science, 2013,339(6121):819-823.

[28]Mali P, Yang L, Esvelt K M,etal. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science, 2013,339(6121):823-826.

[29]Malina A, Mills J R, Cencic R,etal. Repurposing CRISPR/Cas9 for in situ functional assays [J]. Genes Dev, 2013, 27(23): 2602-2614.

[30]Heckl D, Kowalczyk M S, Yudovich D,etal. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing[J].Nat Biotechnol, 2014,32(9): 941-946.

[31]Chen C, Liu Y, Rappaport A R,etal. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia[J].Cancer Cell, 2014,25(5):652-665.

[32]Blasco R B, Karaca E, Ambrogio C,etal. Simple, rapid in vivo generation of chromosomal rearrangements using CRISPR/Cas9 technology[J].Cell Rep, 2014,9(4):1219-1227.

[33]Maddalo D, Manchado E, Concepcion C P,etal. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system[J].Nature, 2014,516(7531):423-427.

[34]Zuris J A, Thompson D B, Shu Y,etal. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro, in vivo[J].Nat Biotechnol, 2015,33(1):73-80.

[35]Platt R J, Chen S, Zhou Y,etal. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing, cancer modeling[J].Cell, 2014,159(2):440-455.

[36]Wang H, Yang H, Shivalila C S,etal. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell, 2013,153(4):910-918.

[37]Yang H, Wang H, Shivalila C S,etal. One-step generation of mice carrying reporter, conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell, 2013,154(6):1370-1379.

[38]Findlay G M, Boyle E A, Hause R J,etal. Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair[J].Nature, 2014,513(7516):120-123.

[39]Gilbert L A, Larson M H, Morsut L,etal. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J].Cell, 2013,154(2):442-451.

[40]Bikard D, Jiang W, Samai P,etal. Programmable repression, activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system[J].Nucleic Acids Res, 2013,41(15):7429-7437.

[41]Gilbert L A, Horlbeck M A, Adamson B,etal. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression, Activation[J].Cell, 2014,159(3):647-661.

[42]Esvelt K M, Mali P, Braff J L,etal. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation, editing[J].Nat Methods, 2013,10(11):1116-1121.

[43]Tanenbaum M E, Gilbert L A, Qi L S,etal. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression, fluorescence imaging[J].Cell, 2014,159(3):635-646.

[44]Konermann S, Brigham M D, Trevino A E,etal. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex[J].Nature, 2015,517(7536):583-588.

[45]Sadelain M, Brentjens R, Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor design[J].Cancer Discov, 2013,3(4):388-398.

[46]Sadelain M, Papapetrou E P, Bushman F D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome[J]. Nat Rev Cancer, 2012,12(1):51-58.

(收稿时间：2015-06-15修回时间：2015-07-12)

[文献标志码][中国图书资料分类号]R394.21A

[文章编号]2095-140X(2015)09-0095-05

[通讯作者]惠玲，E-mail:zyhuil@hotmail.com

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81372177)；全军医药卫生科研基金课题资助项目(CLZLZJB04)

·论著·