张富婷，常德辉，张　斌，李君红，桑春艳，王养民，惠　玲

·论著·

高原环境下大鼠力竭运动后急性肾损伤的研究

张富婷，常德辉，张斌，李君红，桑春艳，王养民，惠玲

[摘要]目的探讨大鼠在亚高原环境及高原环境下力竭运动后不同时间肾损伤程度的变化，以及对急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)各指标进行比较，初步评价不同指标检测AKI的灵敏度与可靠性。方法72只大鼠随机分为亚高原组和高原组，每组36只，再将两组大鼠分别随机分为6个亚组，每组6只，各组取样时间不同。通过对大鼠进行负重游泳至力竭，记录游泳时间，检测力竭后不同时间血清中肌酐、尿素氮以及中性粒细胞明胶酶相关纸质运载蛋白(neutrophil gelatnase associated lipocalin, NGAL)的含量。结果高原组力竭游泳时间明显比亚高原组短(P<0.05)；亚高原组血清肌酐及尿素氮在力竭后12 h时升高(P<0.01)，血清肌酐48 h时依然维持高浓度(P<0.01)，而尿素氮在24 h时恢复到对照组水平，高原组血清肌酐及尿素氮在力竭运动后即刻升高(P<0.01)，6 h后恢复到对照组水平，血清肌酐48 h后又显著升高(P<0.05)，血清尿素氮12 h时又显著升高(P<0.05)，48 h时恢复到对照组水平。亚高原及高原组血清NGAL在力竭后12 h时升高(P<0.05，P<0.01)，在24 h、48 h持续升高。结论高原环境可使大鼠运动能力降低，血清中肌酐、尿素氮以及NGAL都可表征AKI，但NGAL灵敏度高、可靠性强，具有极高的稳定性。

[关键词]急性肾损伤；高原；力竭运动；血清肌酐；血清尿素氮；中性粒细胞明胶酶相关纸质运载蛋白(NGAL)；大鼠

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.09.003

肾脏作为机体内环境稳定的重要器官之一，在人类对高原的适应过程中扮演着极其重要的角色[1]。在高原缺氧、低压环境下，机体的有效循环血量减少，肾脏血流量也相应减少，进而引起肾脏及机体内环境一系列生理、病理改变，严重时可导致急性肾损伤(acute kidney injury， AKI)[2]。目前针对高原缺氧、低压环境引起的AKI尚无有效的早期诊断措施及防治预案，大部分学者研究方向重点集中在高原脑水肿、肺水肿方面，对高原环境下AKI防治重要性认识不足。本研究通过检测高原环境下AKI动物模型中血清生化指标，重点筛查中性粒细胞明胶酶相关纸质运载蛋白(neutrophil gelatnase associated lipocalin, NGAL)的含量。以期其成果可以用于内地首次进入高原人群和高原常驻人群的早期预警诊断。

1材料与方法

1.1实验动物选用2月龄SPF级Wistar雄性健康大鼠72只，体重(200±10)g。由兰州军区兰州总医院实验动物中心提供，动物合格证编号：SYXK(军) 2012-0020，常规条件下适应性饲养1周后开始实验。

1.2试剂及仪器NGAL酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于上海丰翔生物科技有限公司，贝克曼LX20全自动生化检测仪为美国BeckMan公司产品，FLYDWC50-IIA型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州雷航空军械有限责任公司)。

1.3动物分组模型制备将72只Wistar雄性大鼠随机分为亚高原和高原两组，每组各36只。再将两组大鼠分别随机分为6个亚组，每组6只。分别为两种海拔高度的对照组、力竭后0、6、12、24、48 h亚组。亚高原组在兰州市区海拔高度1520 m进行实验，对照组不进行任何训练，其余5组进行负重游泳训练。高原组大鼠在负重游泳前均在亚高原环境下饲养，实验时以2 m/s的上升速度模拟升至海拔高度4500 m，在低压氧舱中模拟高原环境进行负重游泳，对照组不进行任何训练，其余5组进行负重游泳训练。大鼠游泳训练装置均采用100 cm×50 cm×60 cm的玻璃泳槽，水深50 cm，水温(28±2)℃。除对照组外，所有亚高原与高原组大鼠，均在负重游泳前适应性游泳30 min。30 min之后负10%体重游泳，开始计时，每次游泳至力竭。大鼠开始游泳至力竭所用时间为大鼠力竭运动时间，力竭标准以大鼠下沉后10 s不露出水面为度。力竭后的大鼠按时间要求放置在各自的海拔高度饲养。

1.4取样将各组大鼠用乙醚麻醉后，腹正中切开，于下腔静脉采血，收集静脉血于黄头管(分离胶)，3000 r/min离心20 min，取上清血清保存于-80℃冰箱中待测。

2结果

2.1力竭游泳时间亚高原组与高原组组内比较无统计学差异，组间比较差异具有显著性(P<0.05)，见表1。

2.2血清肌酐亚高原组血清肌酐在力竭后12 h时升高(P<0.01)，至48 h时依然维持这种高浓度；高原组血清肌酐在力竭运动后即刻升高(P<0.01)，6 h后恢复到对照组水平，48 h后又显著升高(P<0.05)，见表2。

2.3尿素氮亚高原组血清尿素氮在力竭后12 h时升高(P<0.01)，24 h时恢复到对照组水平；高原组血清尿素氮在力竭运动后即刻升高(P<0.01)，6 h后恢复到对照组水平，12 h时又显著升高(P<0.05)，48 h时恢复到对照组水平，高原组与亚高原组同时间两个亚组之间比较结果不具有统计学意义(P>0.05),见表3。

表1　各组大鼠力竭游泳时间

注：与亚高原组比较，aP<0.05

表2　亚高原组与高原组大鼠力竭后不同时间血清肌酐的变化±s，μmol/L)

注：与亚高原对照组比较，bP<0.01。与高原对照组、6 h组比较，dP<0.01；与高原对照组比较，aP<0.05，与高原12h、24h组比较，cP<0.05；与亚高原组同时间比较，fP<0.01。

表3　亚高原组与高原组大鼠力竭后不同时间血清尿素氮的变化±s，IU/L)

注：与亚高原对照组比较，bP<0.01；与亚高原12 h组相比，aP<0.05。与高原对照组比较，cP<0.05；与高原6 h及24 h组比较，eP<0.05；与高原对照组及48 h组比较，dP<0.01；与高原12 h组比较，fP<0.01

2.4血清NGAL亚高原组血清NGAL在力竭后12 h时升高(P<0.05)，24 h时保持在12 h时的水平，48 h时升高水平极显著(P<0.01)。高原组血清NGAL在力竭运动后12 h升高(P<0.01)，24 h时达到最高值，48 h时有所降低(P<0.05)，但与对照组相比依然具有极显著的差异(P<0.01)，见表4。

表4　亚高原组与高原组大鼠力竭后不同时间NGAL的变化±s，ng/L)

注：与亚高原对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与高原对照组比较，dP<0.01；与高原24 h组比较，cP<0.05，与亚高原组同时间比较，fP<0.01。

3讨论

高原是指海拔3000 m以上，能激发机体发生生物学效应的环境及高度[3-4]。我国幅员辽阔，高原和山地占全国总面积的1/6，随着高原旅游业发展和国家对高原军事训练需求，平原人员进入高原机会越来越多[5]。高原自然环境具有以下特点：空气稀薄、寒冷、风大等[6-7]。其中，空气稀薄、大气压和氧分压低是高原环境影响机体的主要因素，缺氧对于肾脏具有明显的影响，同时高原病诱发或加重AKI的报道也不少见[8]。

肾脏作为机体内环境稳定的重要器官之一，对缺氧十分敏感。在高原缺氧、低压环境下，机体循环血量减少，最终导致AKI[2，9-10]。AKI是指肾脏清除代谢废物能力急剧下降，定义为机体在受到创伤或感染时血清肌酐在48 h内大幅升高且肾脏在结构或功能上发生改变[11-12]。针对高原缺氧、低压环境引起的AKI目前尚无有效早期诊断措施及防治预案，目前大部分学者研究方向仍重点集中在高原脑水肿、肺水肿诊治研究方面，对高原环境下AKI防治重要性认识不足。

目前诊断AKI主要依赖于血清肌酐的大幅增加与少尿症状的产生[13]，最常用的标志物为血清肌酐[14-17]，但都是肾损伤的结果而非肾损伤本身标志物，具有滞后性。研究者通过肾脏对早期损伤压力反应，发现了几种潜在的能够指示AKI的生物标志物。目前最具有应用前景的AKI标志物主要有NGAL、KIM-1、L-FABP及IL-184[18]。有文献报道NGAL是AKI非常具有应用前景的生物标志物之一[19-20]。临床研究发现，在AKI早期，NGAL基因表达大幅上调[21]。下游蛋白组学研究同样证明，在AKI动物模型中，NGAL蛋白同样高强度诱导表达[22]。

本研究表明，大鼠进入高原环境后运动能力远远低于亚高原环境。同时大鼠在运动至力竭后，无论是比较传统的AKI标志物血清肌酐、尿素氮，还是新标志物NGAL，都能够表征AKI。在亚高原环境下，血清肌酐和尿素氮浓度随时间有规律的变化，但是在高原环境下，这两种标志物表现出一定的不稳定性，因而不能够很好的显示AKI的发生及发展。相反，NGAL无论是在亚高原环境还是在高原环境下，都能够准确地表征AKI的进程，且其浓度在AKI发生12 h后即可检测到显著升高，在24 h以及48 h后仍然保持高浓度。因此，相对血清肌酐和尿素氮来说，NGAL在检测AKI的发生与发展过程中具有较强可靠性及灵敏性。通过NGAL的检测结果发现，无论是在亚高原还是高原环境下，大鼠在力竭12 h后可检测到AKI的发生，但是在同一时间下进行比较，高原组NGAL浓度远远高于亚高原组(P<0.01)，从而证明高原组AKI程度比亚高原组严重，这也表明高原环境确实能够诱导AKI发生并促进其发展。

[参考文献]

[1]Arestegui A H， Fuquay R， Sirota J，etal. High altitude renal syndrome (Hars)[J].J Am Soc Nephrol， 2011，22(196)：3-8.

[2]Haditsch B， Roessler A， Krisper P，etal. Volume regulation and renal function at high altitude across gender[J].PLoS One， 2015,10(3)：e0118730.

[3]周艳,牛忠英.微重力对细菌生物学效应的影响[J].空军医学，2015，31(1)：55-57.

[4]Lorna G M， Susan N， Stacy Z. Human adaptation to high altitude:regional and life-cycle perspectives[J].Yearb Phys Anthropol， 1998，107(S27)：25-64.

[5]黄小玉,王荣,尹强，等.急进高原对Wistar大鼠体内甲氧氯普胺片剂药代动力学参数的影响[C].2014:184-185.

[6]West J B. High-altitude medicine[J].Am J Respir Crit Care Med，2012，186(12)：29-37.

[7]张清俊,詹皓.急性高原反应预防措施研究进展[J].解放军预防医学杂志，2013，31(4)：373-375.

[8]Goldfarb-Rumyantzev A S， Alper S L.Short-term responses of the kidney to high altitude in mountain climbers[J].Nephrol Dial Transplant， 2014，29(3)：497-506.

[9]吴晓凤,宋光明.对比剂引起的肾损伤：发病机制及预防[J].武警后勤学院学报，2010，19(3)：226-230.

[10]Rinaldo B， John A K， Claudio R. Acute Kidney Injury[J].Lancet， 2012，380(9843)：756-766.

[11]谢潮鑫,殷先锋,何凤玲,等.天然虾青素对脓毒症大鼠急性肾损伤的作用[J].华南国防医学杂志，2014，28(8)：739-742.

[12]孙铁忠,李鑫宇.药物性急性肾损伤115 例临床分析[J].解放军医药杂志，2012，24(9)：48-50.

[13]Ricci Z， Cruz D N， Ronco C. Classification and staging of acute kidney injury: Beyond the rifle and akin criteria[J].Nat Rev Nephrol， 2011，7(4)：201-208.

[14]Siew E D， Ware L B, Ikizler T A. Biological markers of acute kidney injury[J].J Am Soc Nephrol， 2011，22(5)：810-820.

[15]姚旻,曾山, 涂悦,等.高血压大鼠肾脏基质金属蛋白酶及组织型基质金属蛋白酶抑制剂表达与活性的变化[J].武警后勤学院学报，2013，22(3)：161-165.

[16]任珊,赵鹤龄.脓毒症并发急性肾损伤的早期诊断与干预[J].临床荟萃，2010，25(7)：626-628.

[17]张富婷，惠玲.早期急性肾损伤新标志物—中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白研究进展[J].西北国防医学杂志，2015，36(3)：183-185.

[18]Sirota J C， Walcher A， Faubel S，etal. Urine Il-18, ngal, Il-8 and serum Il-8 are biomarkers of acute kidney injury following liver transplantation[J].BMC Nephrol， 2013,14(17)：1471-1480.

[19]Nickolas T L， O'Rourke M J， Yang J，etal. Sensitivity and specificity of a single emergency department measurement of urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin for diagnosing acute kidney injury[J].Ann Intern Med， 2008，148(11)：810-819.

[20]Devarajan P. Biomarkers for the early detection of acute kidney injury[J].Curr Opin Pediatr， 2011，23(2)：194-200.

[21]Supavekin S， Zhang W， Kucherlapati R，etal. Differential gene expression following early renal ischemia/reperfusion[J].Kidney Int， 2003，63(5)：1714-1724.

[22]Mori K， Lee H T， Rapoport D，etal. Endocytic delivery of lipocalin-siderophore-iron complex rescues the kidney from ischemia-reperfusion injury[J].J Clin Invest， 2005，115(3)：610-621.

(收稿时间：2015-06-18修回时间：2015-07-15)

A Study on Acute kidney Injury after Exhausting Exercise under High Altitude Environment in Rats

ZHANG Fu-tinga, CHANG De-huib, ZHANG Binb, LI Jun-honga, SANG Chun-yana, WANG Yang-minb, HUI-Linga

(a. Medical Experiment CenterKey Lab of Stem Cells and Genetaceutical of Gansu Province, b. Department of Urinary Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate changes of acute kidney injury (AKI) after exhausting excise under high altitude and sub-high altitude environments for different times in rats, and to evaluate the sensitivity and reliability by different indexes detection for AKI after comparing AKI indexes. MethodsA total of 72 rats were randomly divided into high altitude group (group A,n=36) and sub-high altitude group (group B,n=36), and then each group was randomly divided into six subgroups (n=6 for each subgroup) by taking samples with different times. The rats underwent weight-bearing swimming test till exhaustion, and then the swimming time was recorded, and the values of serum creatinine, urea nitrogen and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) content in different times after exhaustion were detected. ResultsThe swimming time of group A was significantly shorter than that of group B (P<0.05). In group B, the values of serum creatinine and urea were significantly increased at 12 h after exhausting exercise (P<0.01); the concentration of serum creatinine kept high at 48 h after exhausting exercise (P<0.01), while serum urea value restored to the level of control group at 24 h after exhausting exercise. In group A, the values of serum creatinine and urea were increased immediately after exhausting exercise (P<0.01), and then the values returned to the level of control group at 6 h after exhausting exercise, while serum creatinine value was significantly increased at 48 h after exhausting exercise (P<0.05), and serum urea value was increased at 24 h after exhausting exercise (P<0.05), and then the value restored to the level of control group at 48 h after exhausting exercise. Values of serum NGAL were increased at 12 h after exhausting exercise in the two groups (P<0.05,P<0.01), and the values were still increasing at 24 h and 48 h after exhausting exercise. ConclusionThe motor abilities of rats can be decreased in high altitude environment. Serum creatinine, urea and NGAL can be markers of acute kidney injury, but NGAL shows better sensitivity, reliability and stability.

[Key words]Acute kidney injury； High altitude； Exhausting exercise； Serum creatinine； Serum urea nitrogen；Neutrophil gelatinase-associated lipocalin； Rats

[文献标志码][中国图书资料分类号]R-322A

[文章编号]2095-140X(2015)09-0013-04

[通讯作者]惠玲，Email:zyhuil@hotmail.com

[基金项目]全军医药卫生科研基金面上项目(CLZ12JA10)；全军医药卫生科研基金面上项目(CLZ12JA08)
[作者单位]730050 兰州，兰州军区兰州总医院医学实验中心、甘肃省干细胞与基因药物重点实验室(张富婷、李君红、桑春艳、惠玲),泌尿外科(常德辉、张斌、王养民)