陈苏宁，张 丽，聂品晶，金钟太



中药益心康对感染CVB3病毒的新生乳鼠体外心肌细胞凋亡及相关因子Bcl-2/Bax表达的影响

陈苏宁，张 丽，聂品晶，金钟太

目的 研究中药益心康对感染柯萨奇病毒嗜心肌毒株3型(Coxsackie virus B，CVB3)新生乳鼠体外心肌细胞凋亡及相关基因Bcl-2/Bax表达的影响，探讨中药益心康治疗病毒性心肌炎的作用机制。方法 原代培养SD大鼠乳鼠体外心肌细胞，建立感染CVB3的体外心肌细胞模型，将乳鼠心肌细胞分为4组：正常组、病毒组、益心康组、利巴韦林组。采用倒置显微镜观察心肌细胞生长情况及病变程度(CPE)，用RT-PCR法检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax的表达。结果 益心康组给药48 h后细胞CPE略轻于利巴韦林。益心康组Bcl-2 mRNA的相对表达量高于病毒组(P<0.01)及利巴韦林组(P<0.05)，而Bax mRNA的相对表达量低于病毒对照组(P<0.01)及利巴韦林组(P<0.05)，且Bcl-2/Bax高于病毒组及利巴韦林组(P<0.05)。结论 中药益心康能减轻心肌损伤，保护乳鼠心肌细胞，其作用机制与下调促凋亡基因Bax、上调抑制凋亡基因Bcl-2、升高Bcl-2/Bax比值有关。

中药益心康；柯萨奇病毒；原代细胞培养；Bcl-2/Bax；RT-PCR

0 引言

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是指嗜心肌病毒感染引起的以心肌非特异性间质性炎症为主要病变的心肌炎，是感染性心肌炎最常见的类型。病毒性心肌炎呈全球性分布，发展中国家居多，各年龄均可发病，儿童及40岁以下成年人居多。目前发现30余种病毒可致病，以CVB3最为常见[1]。目前研究证明其发病机制可能与免疫损伤、炎性细胞浸润及细胞凋亡等机制密切相关；而细胞凋亡在病毒性心肌炎发病过程中的地位越来越受到国内外学者的重视[2-4]。Bcl-2、Bax是细胞凋亡中重要的调节因子[5]，本文采用体外原代心肌细胞培养的方法，应用中药益心康作用于感染CVB3的SD乳鼠体外心肌细胞模型，探讨其对心肌细胞凋亡及凋亡相关因子Bcl-2、Bax表达的影响；并进一步探索中药益心康抗凋亡作用及治疗病毒性心肌炎的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 选用200只1～3 d龄清洁级出生的SD大鼠的乳鼠[6]，雌雄均可，用于心肌细胞原代培养，均购于中国医科大学动物实验中心。

1.2 实验病毒 CVB3病毒株为Nancy标准株[7]，购于辽宁中医药大学病毒实验室。

1.3 益心康药物组成 人参、黄芪[8]、金银花、连翘、板蓝根、白术、丹参、甘草，中草药饮片(购于辽宁中医药大学附属医院中药局)，利巴韦林注射液(华北制药集团制药有限公司，购于中国医科大学附属盛京医院西药局)。

1.4 主要试剂和仪器 胎牛血清(美国GIBCO 10091-148)；0.25%胰酶-EDTA(美国GIBCO 25200-056)；TRIZOL总RNA提取试剂(Invitrogen 1203406)；RT-PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)BK2701]；倒置显微镜(德国来卡 LEITZDMIL)；低速离心机(江苏金坛800)；生物安全柜美国(NUAIR NU-425-400E)；二氧化碳培养箱(美国NUAIR 4950E)；水浴恒温振荡器(江苏SHA-B)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-52A)；电泳槽(北京六一 DDY-Ⅲ)；电泳仪(上海天能EPS-300)；PCR仪(美国PE 9600)；凝胶和图象处理系统(上海天能GIS-120D)。

2 实验方法

2.1 益心康药液的制备 340 g中药饮片洗涤后混合，加8倍水文火煎煮1 h (金银花、连翘、板蓝根后下)，倒出药液加6倍水文火煎煮1 h，反复煎煮3次后，混合3次药液过滤后加入95%乙醇，使药物含醇量达80%，醇沉后药液含药量为1 g/mL，静置48 h后取上清，高压灭菌后4 ℃保存备用(由辽宁中医药大学药学实验室提取)[9]。

2.2 细胞生长液配置 由一级胎牛血清、DMEM、青霉素、链霉素、Brdu混合组成。

2.3 CBV3病毒制备及测定

2.3.1 CVB3病毒制备 取培养好的HeLa细胞，加入CVB3病毒原液1 mL，培养1 h后，反复清洗3次，加入生长液继续培养，待24 h后倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)达到75%～100%即符合要求，反复吹打HeLa细胞并低温冻融3次，离心过滤后冻存管分装，-80 ℃保存备用。

2.3.2 CVB3半数组织感染量(TCID50)的测定[7]用Reed-Muench法计算，TCID50为10-3.9，因此，CVB3(Nancy株)的半数组织感染量(TCID50)约为10-4。

2.4 益心康、利巴韦林对心肌细胞最大无毒剂量测定 将中药益心康药液按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024 比例进行稀释后加入96孔心肌细胞培养板，当药物最大浓度为1/512时，药物对心肌细胞未见明显的细胞毒性，换算可知益心康对乳鼠心肌细胞的最大无毒剂量为1.96 mg/mL；方法同前，利巴韦林最大药物浓度为1/16时，药物对细胞未见明显的细胞毒性，换算可知利巴韦林对乳鼠心肌细胞的最大无毒剂量为6.25 mg/mL。

2.5 乳鼠心肌细胞的制备[10-12]取SD乳鼠200只断颈处死，无菌条件下开胸取心脏，剪成1 mm3碎块，加入0.25%%胰酶-EDTA反复消化3次，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化、离心、弃上清，加入含5%胎牛血清的DMEM培养液并离心，重复2次后弃上清，加入培养液制成细胞悬液，200目筛网过滤，经细胞计算器计数后，放入37 ℃ 5%的二氧化碳培养箱。

2.6 病毒性心肌炎细胞模型的建立[12-15]将培养好的心肌细胞采用随机分配的方法分成4组：正常组(A组)、病毒组(B组)、益心康组(C组)、利巴韦林组(D组)。分别向已培养48 h的B组、C组、D组中加入病毒液3 mL (病毒毒力为10-4TCID50)，向A组加等量生长液，培养1 h后，弃病毒液并反复清洗3次，分别向A组、B组加入生长液6 mL，向C组中加入益心康中药液6 mL (浓度为最大无毒剂量)，向D组中加入利巴韦林药液6 mL (浓度为最大无毒剂量)，继续置于5%的CO237 ℃培养箱中培养，分别于24、48 h后倒置显微镜下观察心肌细胞数量、形态、贴壁和搏动情况，并更换培养液。

2.7 采用RT-PCR方法检测感染CVB3心肌细胞中Bcl-2及Bax基因的表达情况

2.7.1 提取总RNA 按照TRIZOL总RNA提取试剂(Invitrogen 1203406)操作，提取体外心肌细胞的总RNA，并于紫外分光光度计测总RNA浓度；测A260 nm/280 nm比率>1.60，RNA纯度较好。

2.7.2 反转录(Reverse transcription，RT) 取1 μL的总RNA加入已调制好的20 mL反应液中，混合均匀后按下列条件进行反转录反应(PE 9600 PCR仪34号程序)：65 ℃ 1 min，30 ℃ 5 min，15～30 min内匀速升到65 ℃ 15～30 min，98 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

2.7.3 聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR) 检索SD大鼠基因文库中Bcl-2、Bax 及GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)的cDNA 序列，分别设计其扩增引物(引物合成公司：北京六合华大基因科技有限公司)，如表1。

表1 Bcl-2、Bax及GAPDH引物序列基因

反应体系及反应条件如下。调制反应液(80 μL)：MgSO46 μL，5*Buffer 16 μL，Taq 0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dH2O 55.5 μL；将20 μL cDNA加入反应液中，轻轻混合；按以下条件进行PCR反应(PE 9600 PCR仪17号程序)：94 ℃预变性3 min，进入PCR循环，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，72 ℃延伸5 min。

2.7.4 琼脂糖凝胶电泳 取反应液10 μL与上样缓冲液2.5 μL混匀，以含溴乙锭的2%琼脂糖电泳30 min (电压为5 V/cm)，紫外分析仪(波长为254、302、366 nm)上观察电泳条带，其荧光带亮度可随凋亡的程度而变化，检测目的基因在心肌细胞中mRNA水平的表达峰值。

2.8 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件包进行数据统计分析，多样本均数的比较采用单因素方差分析法，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 心肌细胞形态学观察 药物干预48 h后，倒置显微镜下观察显示，正常组贴壁生长的心肌细胞形态呈不规则的多角形、圆形核位于中央，生长时常彼此交联形成单层细胞，呈同步搏动，节律规整，频率约为50～90次/min。病毒组的心肌细胞数量减少，形态皱缩脱壁，搏动幅度减小，搏动频率变快，同步搏动消失；益心康组细胞病变较轻，部分细胞搏动无力，搏动幅度减小，节律欠规整；益心康组细胞CPE略轻于利巴韦林组。见图1～图4。

图1 正常组48 h心肌细胞形态(×200)

图2 病毒组48 h心肌细胞形态(×400)

图3 益心康组48 h心肌细胞形态(×200)

图4 利巴韦林组48 h心肌细胞形态(×200)

3.2 采用RT-PCR法检测心肌细胞中凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的表达情况 益心康组Bcl-2 mRNA的相对表达量高于病毒组(P<0.01)及利巴韦林组(P<0.05)，而Bax mRNA的相对表达量低于病毒对照组(P<0.01)及利巴韦林组(P<0.05)，且Bcl-2/Bax高于病毒组及利巴韦林组(P<0.05)。见表2、图5～图6。

表2 药物干预对乳鼠心肌细胞Bcl-2及Bax mRNA表达的影响(%)

注：*与正常组比较，P<0.01；#与病毒组、利巴韦林组比较，P<0.05

图5 PT-PCR法检测CVB3病毒感染的新生乳鼠体外心肌细胞Bcl-2 mRNA的表达情况

注：1、2为正常对照组，3、4为病毒对照组，5、6为益心康中药组，7、8为利巴韦林组

图6 PT-PCR法检测CVB3病毒感染的新生乳鼠体外心肌细胞Bax mRNA的表达情况

注：1、2为正常对照组，3、4为病毒对照组，5、6为益心康中药组，7、8为利巴韦林组

4 讨论

细胞凋亡(Apoptosis)不同于细胞坏死，是由体内外因素触发的程序性细胞死亡[16]。凋亡是正常的生理过程，能够确保正常的生长发育，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能，但凋亡过多或过少均可引起疾病的发生。该学说在九十年代初才进入研究高潮，近年来已成为医学界的关注热点。而凋亡家族Bcl-2是细胞凋亡中最受重视的基因之一，Bcl-2的过量表达能阻滞多种凋亡诱导因素所引发的细胞凋亡，具有抗凋亡作用[17]；相反，Bax过量表达可抑制Bcl-2功能而促进细胞凋亡[18]，因而可以认为Bcl-2/Bax值决定了细胞是否发生凋亡[19-20]。

本研究发现，益心康组在感染CVB3的乳鼠心肌细胞中Bcl-2表达增多，明显高于病毒组与利巴韦林组；而Bax表达减少，明显低于病毒组与利巴韦林组；Bcl-2/Bax值升高。结果表明，中药益心康组可抑制心肌细胞中促凋亡基因bax表达，促进抑制凋亡基因Bcl-2表达，增强了感染CVB3乳鼠心肌细胞的抗凋亡作用，且抗心肌细胞凋亡的疗效优于利巴韦林组。目前西医治疗此病无特效药物，一般采用对症治疗，而中药对于此病的治疗取得了良好效果[21]。

中医传统理论认为此病多由外感之邪，侵犯机体，损伤心脉，阻滞气血，日久耗伤气阴，益心康由人参、黄芪、金银花、连翘、板蓝根、白术、丹参、甘草等药物组成以清热解毒，益气养阴、活血化瘀。本课题组前期试验证实了益心康在心肌细胞中抑制CVB3复制、降低TNF-α、TGF-β表达中发挥重要作用，且对柯萨奇病毒感染心肌细胞具有保护作用[22]，但益心康治疗VMC的作用机制尚未完全阐明。细胞凋亡是造成病毒性心肌炎心肌损伤的重要机制，但中药益心康在治疗VMC中的抗细胞凋亡机制尚不清楚，本研究证实了中药益心康能够下调VMC乳鼠心肌细胞中的促凋亡基因Bax，上调抑制凋亡基因Bcl-2，升高Bcl-2/Bax，具有减轻心肌损伤、保护心肌细胞的作用，为中药益心康治疗病毒性心肌炎提供了新的理论依据。

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Effect of yixinkang soup on the apoptosis of cardiomyocytes and the expression of related gene Bcl-2/Bax in the newborn suckling rats infected by CVB3virus

CHEN Su-ning,ZHANG Li,NIE Pin-jing,JIN Zhong-tai

(Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To study the effect of yixinkang soup on the apoptosis of cardiomyocytes and the expression of related gene Bcl-2/Bax of newborn suckling rats infected by CVB3virus,and explore the mechanism.Methods The original generation of SD rat cardiomyocytes were cultivated,and CVB3infection cardiomyocyte model was established.The cardiomyocyte were divided into 4 groups:normal group,virus group,yixinkang group and ribavirin group.The apoptosis of cardiomyocytes was observed using flow instrument,and the expression of apoptosis related genes Bcl-2 and Bax was observed by RT-PCR method.Results After 48 h,CPE of yixinkang group was slightly lighter than ribavirin group.The expression of Bcl-2 mRNA in yixinkang group was higher than virus group (P<0.01) and ribavirin group (P<0.05).The expression of Bax mRNA in yixinkang group was lower than virus group (P<0.01) and ribavirin group (P<0.05),and Bcl-2/Bax was higher than virus group and ribavirin group (P<0.05).Conclusion Yixinkang can alleviate myocardial injury,it has protective effects on the rats′ cardiomyocytes.The mechanism of action is related to the down-regulation of Bax,up-regulation of Bcl-2,and the increase of Bcl-2/Bax.

Yixinkang;Coxsackie virus;Primary cell culture;Bcl-2/Bax;RT-PCR

2015-05-28

中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110004

沈阳市科学技术计划项目(F10-205-1-76)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511002